胡杨Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及功能研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 吴雨霞 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2006-11-07 |
| 授予单位 | 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 |
| 授予地点 | 寒区旱区环境与工程研究所 |
| 导师 | 张立新 |
| 关键词 | 基因克隆 Na+/H+逆向转运蛋白基因 胡杨 RACE 耐盐 |
| 学位专业 | 自然地理学 |
| 中文摘要 | 本文以耐盐性较强的胡杨（Populus euphratica）为试材，根据植物中Na+/H+ 逆向运转蛋白基因的保守区域设计简并引物，采用RT-PCR与RACE法，对胡杨Na+/H+逆向运转蛋白进行基因克隆、序列比较、功能鉴定和表达分析, 并对其耐盐性关系进行了初步研究, 主要结果如下： 从胡杨中克隆到一条长为3665 bp的cDNA序列，该基因含有一个54 bp 的 5′ 非编码区、长为3438bp的开放阅读框，和一个173 bp的3′ 非编码区，编码一个1146个氨基酸的多肽，推测其分子量为127 kDa。将所得序列在GenBank中进行同源性比较，结果表明该基因属于Na+/H+逆向运转蛋白基因家族，而且与拟南芥的基因具有极高的同源性，将该基因命名为PeSOS1（GenBank Acc. No. DQ517530）。用TMPRED软件分析表明，PeSOS1蛋白N端有12个可能的跨膜区段。这与拟南芥质膜型Na+/H+逆向转运蛋白SOS1 N端有12个跨膜区一致。 运用ClustalW软件对PeSOS1进行序列比对，发现该基因的核苷酸序列及其推导出的氨基酸序列与其它植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因有一定的相似性，同源序列比较发现，胡杨Na+/H+逆向运转蛋白与已知的其它质膜型Na+/H+逆向转运蛋白也有较高的同源性：与拟南芥、水稻、小麦的质膜Na+/H+逆向运转体序列同源性分别为 63.35%, 61.21% 和 60.74%，而与酵母、野滨藜和拟南芥液泡型Na+/H+逆向运转体的序列同源性很低，分别约为19.4%，19.0%和17.7%。系统发育分析也表明 PeSOS1与拟南芥、水稻、小麦和酵母质膜型 Na+/H+逆向运转体的亲缘关系很近，与液泡型的Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系较远。因此推断所获得的全长cDNA 的编码产物可能是质膜型 Na+/H+逆向运转体。 将PeSOS1转入大肠杆菌突变体EP432（EcNhaA 和 EcNhaB均缺失）菌株，结果表明PeSOS1可显著恢复突变菌株对高盐的敏感性，与阴性对照相比，在200 mmol/L NaCl胁迫下，转基因细菌中Na+离子含量有所降低，K+含量明显增加，K+/Na+增加较多。说明PeSOS1基因具有与大肠杆菌Na+/H+ 逆向转运蛋白（EcNhaA 及 EcNhaB）基因相似的功能。 半定量RT-PCR分析结果表明，在200 mM NaCl处理下，PeSOS1的转录水平迅速增加，2小时之后达到较高的水平，4小时之后达到最高值，并且在24小时的处理时间内一直维持在很高的水平。 从PeSOS1中选取3′ 端大约510 bp 的亲水区域构建原核表达载体 pET-Pe510，并在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达融合蛋白，亲和层析纯化以后，溶于PBS中获得抗原，免疫兔子制备PeSOS1抗体。 采用制备的抗体进行Western-blotting分析表明 PeSOS1的表达在胡杨根200 mM NaCl 处理下与诱导的时间成正比；在叶中，在没有用200 mM NaCl处理的PeSOS1 蛋白基因有一定的微量表达，而用 NaCl 处理 12 h、24 h和 48 h的胡杨，PeSOS1基因的表达显著增加；在胡杨茎中200 mM NaCl 处理下PeSOS1基因有微量表达。表明PeSOS1基因是一个诱导表达型基因，并且其表达具有组织特异性。这与其它的 Na+/H+逆向转运蛋白基因有相似的结果。 PeSOS1基因的克隆及功能研究为进一步利用Na+/H+逆向转运蛋白基因开展植物耐盐性研究提供了基础。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-08-22 |
| 页码 | 112 |
| 源URL | [http://ir.casnw.net/handle/362004/21555]  |
| 专题 | 寒区旱区环境与工程研究所_研究生学位论文_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 吴雨霞. 胡杨Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆及功能研究[D]. 寒区旱区环境与工程研究所. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所. 2006. |
入库方式： OAI收割
来源：寒区旱区环境与工程研究所
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