高山冰缘植物高山离子芥抗冻机理的分子生物学研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 王建辉 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2005 |
| 授予单位 | 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 |
| 授予地点 | 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 |
| 导师 | 安黎哲 |
| 关键词 | 高山离子芥 抗冻 cDNA文库 基因克隆 抑制重结晶 抗脱水 叶绿体 六角形相位 转基因 |
| 其他题名 | Molecular Biological Studies on Freeze-tolerant Mechanism of Subnival Plant Chorispora Bungeana |
| 中文摘要 | 临近雪线的高山植被带上部，存在一类空间分布间断的斑块植被组成的稀疏高山植被，被我国学者命名为高山冰缘植被，本论文把特异性分布在高山冰缘植被带的植物物种称为高山冰缘植物，并以高山冰缘植物中的高山离子芥为研究材料，利用分子生物学技术，分析其在小分子、蛋白质、DNA、细胞、植株等水平上的抗冻活性，取得以下研究成果。1．通过组织培养技术，建立了由野生植株叶片产生的体细胞胚悬浮体系，并经过体胚发生和转化得到生根良好的高山离子芥植株，为进行深入研究提供了材料基础。同时通过制作体细胞胚的原生质体，利用滴片技术进行了染色体数目分析1首次报道了高山离子芥的染色体数目为14条。2．通过蔗糖调控实验，发现较高浓度蔗糖对高山离子芥植株再生过程有促进作用，90k蔗糖浓度下，再生植株主根粗壮并出现与野生植株一致的异形叶的现象，可能是高浓度蔗糖提供了一种渗透胁迫环境，并且边缘深裂的叶形态有可能与抗逆有关。3．通过对愈伤组织的抗冻生理指标测定，发现高山离子芥在0℃和-4℃低温下，可溶性糖、脯氨酸含量明显升高，并且保持超常的TTC活性，表现出明显的抗冻特征，并说明高山离子芥在低温下可以通过积累渗透调解物质来提高抗冻性育旨。4．通过自主发明的系统分离高山离子芥冰晶结合蛋白，并用自主发明的冰晶观察系统进行抑制重结晶的分析，发现高山离子芥存在多种冰晶结合蛋白，其混合组份显示了冰晶抑制活性，表明高山离子芥体内含有抑制重结晶的抗冻蛋白；同时通过自主改造套管离心法分离冷诱导的质外体热稳定蛋白，发现了其冰晶抑制活性，说明在外质体内的抑制重结晶活性的蛋白组份受低温的诱导产生。这些结果表明，高山冰缘植物很可能通过积累抗冻蛋白来适应反复冻融的冰缘气候，其冰晶抑制活性是其抗冻机理中的重要组成部分。5．利用SMART技术构建了高山离子芥冷诱导cDNA文库，并且可以随噬菌体载体通过转染大肠杆菌日M25.8自身重组转变成cDNA质粒载体文库。前期实验通过对功能基因的片断扩增，发现与十字花科拟南芥属和芸苔属已知基因的高度同源性，所以根据十字花科已知抗冻相关的基因设计简并引物，扩增了冷诱导转录因子CBF基因、稳定叶绿体的膜结构的C0R15基因、抗脱水蛋白LEA基因、渗透调节的BADH、PSCS基因等的高度同源的序列，并证明这些基因在高山离子芥中都受低温的诱导。通过分子信息学手段，对序列进行了系统发生树的构建和蛋白质结构功能的预测，发现CBF中含有APZ结构域；BADH中含有ALDH一11ke结构域；PSCS中含有ALDH-like和Carbomatekinose-like结构域，说明这些基因比较保守。LEA和COR15具有高比例亲水性的Q螺旋，是具有抗脱水功能的蛋白。COR15基因具有穿膜活性，BADH、PSCS和LEA也具有潜在的跨膜蛋白结构，可能在靠近膜时发挥对膜结构的保护作用。6．构建了高山离子芥COR15基因的核转化载体，利用农杆菌介导的方法转化烟草，发现TO代转基因植株在一2℃处理8h后存活率明显高于对照；在冷冻处理过程中，转基因植株叶绿素含量和膜通透性的抗冻特性明显优于对照植株；电子显微镜观察发现对照在一2℃处理8h后类似Hll相变的现象，而转基因植株则不明显。以上结果说明高山离子芥COR15基因具有低温下保护叶绿体膜和细胞膜的功能，尤其是对叶绿体保持功能具有重要意义。7．通过剔除COR15穿叶绿体膜的导肤编码序列，构建COR15的叶绿体转化载体，通过基因枪转化法，进行对烟草的转化，现己检测到报告基因GFP的表达。以上研究表明，高山离子芥较强的抗冻性能，其抗冻机理模式可能为，通过快速的信号转导启动抗冻相关基因的表达调控系统，积累渗透调节小分子物质（甜菜碱、脯氨酸等）、抑制重结晶的蛋白（抗冻蛋白）、抗脱水的蛋白（如LEA蛋白）、对细胞的膜结构有保护作用的蛋白等（如C0R15蛋白）等。高山离子芥可能积累了优秀的抗冻基因资源，不仅可以为转基因作物的提供外源基因，也是进行抗冻机理的基础理论研究的好材料，将来可作为抗冻分子生物学研究和抗冻基因工程研究的模式植物。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-08-22 |
| 页码 | 90 |
| 源URL | [http://ir.casnw.net/handle/362004/22036]  |
| 专题 | 寒区旱区环境与工程研究所_研究生学位论文_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王建辉. 高山冰缘植物高山离子芥抗冻机理的分子生物学研究[D]. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所. 2005. |
入库方式： OAI收割
来源：寒区旱区环境与工程研究所
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