体细胞介导的核移植中转基因供体细胞的选择方法探讨及乳腺特异表达 hBPI 载体的构建
文献类型：学位论文
| 作者 | 马海蓉 |
| 学位类别 | 理学博士 |
| 答辩日期 | 2006-11-30 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 汪汉卿 ; 曹旭 |
| 关键词 | 乳腺表达载体pBC1 体细胞介导的核移 人细菌透性增加蛋白cDNA 共转染 基因克隆 mammary gland-specific expression vector somatic cellmediated nuclear transfer human bactericidal/permeability-increasing protein co-transfection gene cloning |
| 学位专业 | 物理化学（含：化学物理） |
| 中文摘要 | 利用动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白具有活性好、易提纯、产量高、成本低等特点，已经作为一种新的生物制药模式崭露头角。选择高效的乳腺特异调控元件、合适的目的基因以及有效的表达载体转入动物体内的方法等是乳腺生物反应器制备中的重要环节。 本项研究首先选择携带β－酪蛋白启动子等调控序列的pBC1－GFP 为乳腺特异表达载体，以核移植技术作为表达载体转入动物体内的方法，探讨了一种共转染方法在成年绵羊体细胞介导的核移植技术中对于转基因供体细胞选择的可行性。结果表明，共转染方法能够应用于体细胞介导的核移植技术中转基因供体细胞的选择，并且它有潜力扩展到利用乳腺生物反应器生产功能蛋白及其它与核移植相关的转基因研究中。 继而，选择一种人体内天然抗感染的分子靶－人细菌透性增加蛋白的cDNA作为目的基因。从新疆维吾尔族健康人造血干细胞中提取总RNA，用反转录和降落PCR 相结合的方法扩增得到人细菌透性增加蛋白的cDNA，将其克隆到pEGFP-N1载体上(命名为pEB1),并进行DNA 序列测定。结果表明，所克隆的hBPIcDNA 全长为1,464 个碱基，与GENEBANK 中另外4 个序列进行了比对后发现，该序列有两个碱基与其它4 个序列不同：第576 位碱基其它序列为G，本文是C; 第676位碱基其它序列为A，本文是G。其中第676 位碱基的变化导致第185 位氨基酸由Lys 改变为Glu。本研究倾向于认为这些差异是由于hBPI mRNA 本身的多肽性引起的。 然后，探讨人细菌透性增加蛋白(hBPI)在人乳腺癌细胞MCF-7 中的表达和亚细胞定位。以本人克隆得到的质粒pEB1 为模板，利用一对带有Kozak 序列以及删除终止密码子的引物进行PCR, 获得的产物与pEGFP-N1 载体连接，构建了哺乳细胞特异表达载体pEB2。用此表达载体稳定转染MCF-7 细胞，获得了转基因细胞系。荧光显微镜观察显示，BPI－EGFP 融合蛋白分布在整个细胞质中，并且在核膜周围有高表达。提取其基因组DNA，PCR 扩增证实BPIcDNA 片断和EGFP片断已整合入MCF-7 细胞基因组中。 RT-PCR 的结果在转录水平上证明了hBPI-EGFP 融合蛋白在MCF-7 细胞中的表达。 最后，构建了乳腺特异表达人细菌透性增加蛋白载体。通过PCR 反应和双轮PCR 反应分别得到带有自身信号肽或山羊酪蛋白信号肽的人细菌透性增加蛋白cDNA，连入pBC1 载体上，成功地构建了两个乳腺特异表达载体pBC1-BPI1 和pBC1-BPI2。 以上研究为首次用体细胞介导的核移植的方法在动物乳腺中表达人细菌透性增加蛋白做好了准备工作。 |
| 学科主题 | 基因工程制药 |
| 公开日期 | 2013-05-24 |
| 源URL | [http://210.77.64.217/handle/362003/3072]  |
| 专题 | 兰州化学物理研究所_中科院西北特色植物资源化学重点实验室/甘肃省天然药物重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 马海蓉. 体细胞介导的核移植中转基因供体细胞的选择方法探讨及乳腺特异表达 hBPI 载体的构建[D]. 中国科学院研究生院. 2006. |
入库方式： OAI收割
来源：兰州化学物理研究所
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