重离子束辐照诱导酿酒酵母线粒体损伤及其组学研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 张苗苗
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| 答辩日期 | 2018-12-01 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所) |
| 授予地点 | 中国科学院大学 |
| 导师 | 李文建 |
| 关键词 | 重离子束 酿酒酵母 线粒体损伤 脂质代谢组学 转录组测序 |
| 期号 | 09 |
| 英文摘要 | 重离子束辐照会造成酿酒酵母DNA单链、双链断裂或DNA团簇损伤,导致DNA碱基转换、颠换、碱基片段插入或删除等突变,若这些突变中的一种或多种同时发生在线粒体内,就会导致线粒体损伤,引起酵母呼吸功能丧失,生长繁殖速度变缓,菌落形态变小,细胞内碳循环代谢途径等发生改变。本研究利用碳离子束对处于对数生长期的酿酒酵母BY4743进行辐照处理,通过红四氮唑(TTC)平板显色反应,筛选得到10株可稳定遗传的线粒体损伤型酵母突变体,通过增殖速率和呼吸强度检测,复筛到5个线粒体受损明显的突变体,其线粒体膜电位均有不同程度降低,借助基因组测序确定了线粒体DNA大片段缺失是造成突变体生理表型发生变化的重要原因。通过脂质代谢组学和转录组学的联合分析,初步认为YRO374W上调表达是引起突变体甘油三酯(TG)相对含量升高的主要原因;YBR029C表达对磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰丝氨酸(PS)的相对含量影响较为明显。Res D-4中,YNL169C下调表达直接导致了磷脂酰乙醇胺(PE)相对含量的降低;Res D-1中,YJL134W极显著性上调表达和YOL011W极显著性下调表达,可能会导致鞘脂类和甘油磷脂类代谢途径发生改变。以上研究结果初步揭示了重离子束辐照诱导酿酒酵母线粒体损伤后酵母细胞脂质成分发生变化的机理原因;并且鉴于酿酒酵母模式生物的重要性,本研究结果还可为高等真核生物线粒体损伤相关机理研究提供理论参考。论文的主要研究内容和实验结果如下:(1)采用能量为80 Me V/u、剂量率为20 Gy/min的碳离子束对酿酒酵母BY4743进行不同剂量(30、60、90、120、150、180 Gy)的辐照处理。采用平板菌落计数法测定酵母细胞致死率,绘制酵母存活曲线,确定了半致死剂量为60 Gy。基于TTC平板显色实验,筛选到10个线粒体受损的酵母突变体,并发现150 Gy时,突变体筛选率最高。酵母经碳离子束辐照后的生长曲线可将辐照剂量划分为低、中、高三个等级,高剂量(180 Gy)对酵母有较强的致死作用。(2)对初筛到的10个突变体的增殖速率和呼吸强度进行测定,发现增殖速率低于对照50%的突变体占80%,呼吸强度低于对照50%的突变体占90%。据此,复筛到5个线粒体受损明显的突变体,分别命名为Res D-1、Res D-2、Res D-3、ResD-4、Res D-5,采用流式细胞仪检测经罗丹明123(Rh123)染色后的突变体细胞线粒体膜电位,发现所有突变体线粒体膜电位比对照降低了10倍左右。基于基因组测序数据,对线粒体基因组覆盖深度进行比对,发现突变体线粒体基因组呈现大片段缺失,结合核基因组结果,推断线粒体DNA损伤是表型发生变化的重要原因之一。(3)采用超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱(UHPLC-ESI-MS)技术,结合多元变量及单变量的数据分析方法,检测分析了5个突变体的脂质成分。质量控制(QC)样本证明了本研究中使用的分析检测系统稳定,对照组和突变体组中共鉴定出648种脂质分子,分为25个脂质亚类,其中中性脂质TG有140种,占总脂质的21.6%,其次为磷脂类。总体样本PCA结果能准确实现对照和突变体的区分,并且根据样本在PCA得分图上的分布,确定了Res D-1和Res D-4为主要研究对象。(4)对鉴定到的648种脂质分子进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),结果表明,OPLS-DA能准确实现Res D-1、Res D-4与Control的区分;变量权重值(VIP)、变异倍数(FC)、差异性(p)分析相结合,Res D-1中筛选出DG(16:0/18:1)、LPC(16:0)、LPE(14:0)、LPI(16:0)、PA(16:1/18:1)、PC(24:0)、PE(16:0/10:0)、PI(18:0/18:1)、PS(16:0/16:1)、TG(16:0/10:0/16:1)等10个亚类,51种显著性差异脂质分子;Res D-4中筛选出DG(16:0/18:1)、LPC(18:1)、LPE(16:0)、LPI(18:1)、LPS(18:1)、PA(16:0/18:1)、PC(31:1)、PE(16:0/10:0)、PI(15:0/18:1)、PS(16:0/16:1)、SQDG(37:4)、TG(15:0/16:0/18:1)等12个亚类,54种显著性差异脂质分子。显著性差异脂质分子相对含量分析显示,Res D-1/Control中DG、TG、LPI、PA、PI含量升高,LPC、LPE、PC、PE、PS含量下降;Res D-4中DG、TG、SQDG、PA、PC、PI、LPC、LPE、LPI的含量升高,PE、PS、LPS的含量下降。显著性差异脂质聚类分析结果可用于筛选脂质标志物,也可为寻找相似脂质代谢通路提供便捷。基于上述实验结果,构建了DG、PA、PI、PS等部分脂质的代谢途径。本研究表明酿酒酵母可能通过调节脂质成分的含量来应对重离子束辐照引起的线粒体损伤,显著性差异脂质分子可能是重离子束辐照诱导酿酒酵母线粒体损伤后的潜在标志物。(5)基于RNA-Seq技术,完成了Control和Res D-1、Res D-4共9个样本的转录组测序,获得了6252个基因。对测序获得数据进行质量检测和比对效率统计,证明了测序数据和参考基因组均能满足实验数据分析要求。SNP分析结果表明,突变体中发生的SNP是背景突变,重离子束辐照诱导的酵母线粒损伤才是突变发生的主要原因。差异倍数(FC)和错误发现率(FDR)相结合,Res D-1、Res D-4 vs Control分别筛选到622和1011个差异表达基因。Res D-1、Res D-4 vs Control注释到GO二级节点的DEG分别为445和741个,注释到生物学过程的DEG所占比例最高,超过40%;与COG数据库比对,Res D-1、Res D-4 vs Control注释到的DEG总数为339、555个;与KOG数据库比对,注释到的DEG总数为439和769个;COG和KOG注释结果显示,DEG注释最多的分类均是“一般功能预测”;Res D-1 vs Control中,COG和KOG注释到脂质运输和代谢的DEG分别占2.65%、5.24%;Res D-4 vs Control中,COG和KOG注释比例分别为1.44%、3.77%。KEGG Pathway分析结果显示,Res D-1、Res D-4 vs Control分别注释到160和233个DEG,碳代谢、氨基酸生物合成及嘧啶代谢途径注释到的DEG最多;与脂质代谢相关的通路有9条,分别归于脂肪酸生物合成与降解、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类和固醇类5个方面,Res D-1、Res D-4 vs Control分别有20和23个与脂质代谢相关的DEG发生了变化,占KEGG总DEG的12.5%和9.87%,以上DEG均以下调为主。(6)基于脂质代谢通路中注释到的DEG,选择了YIL009W、YOR374W、YBR029C、YBR042C、YBR183W等16个关键基因对其表达水平进行q RT-PCR验证,该16个关键基因的转录水平与RNA-Seq数据能够较好的对应,说明转录组测序结果能准确反应突变体中脂质代谢物相关基因的差异表达情况。 |
| 语种 | 中文 |
| 页码 | 125 |
| 出处 | 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所) |
| 源URL | [http://119.78.100.186/handle/113462/135730]  |
| 专题 | 近代物理研究所_直线加速器中心 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张苗苗. 重离子束辐照诱导酿酒酵母线粒体损伤及其组学研究[D]. 中国科学院大学. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所). 2018. |
入库方式： OAI收割
来源：近代物理研究所
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