肾纤维化是多种慢性肾病发展的终末阶段，肾脏上皮细胞的上皮间充质转化（EMT）是诱使肾纤维化的主要诱因之一，所以抑制EMT可有效地减缓肾脏的纤维化进程。褐藻多糖硫酸酯是一种褐藻中提取出的硫酸化多糖，已经被证明对多种肾脏疾病具有治疗作用。褐藻多糖硫酸酯的分子量对其生物活性有很大影响，本实验探究不同分子量褐藻多糖硫酸酯的制备及其在TGF-β1诱导的小鼠肾小管上皮细胞（MTEC）模型中的抗EMT活性。

（1）使用氧化降解法降解褐藻多糖硫酸酯（FPS）制备了不同分子量的褐藻多糖硫酸酯，通过探究反应时间、反应温度和氧化剂浓度对降解产物分子量的影响，得到了合适的降解工艺参数；根据降解产物的分子量，选取了合适的制备工艺，并制备了三批降解产物。通过对三批产物进行化学分析，验证了该工艺的稳定性，并选取其中一批化学成分相似但相对分子量分布在3.3 KDa到49.3 KDa的褐藻多糖硫酸酯样品（LHX 1-9）进行了单糖含量测定与红外光谱分析，结果表明，LHX 1-9与FPS间各单糖比例基本相同，且红外吸收峰的峰型与位置也基本相同，表明本降解工艺可以保持褐藻多糖硫酸酯的糖链结构不变。

（2）采用6ng/ml的TGF-β1对MTEC细胞进行建模，细胞出现典型的间充质细胞特征。细胞形态使用倒置显微镜进行观察和记录，细胞活力测定使用CCK-8试剂盒，EMT标志蛋白的表达使用蛋白免疫印迹法和细胞免疫荧光法进行检测。结果表明，LHX 1 (Mw=3.3 KDa) 和 LHX 3-9 (Mw=6.6 KDa, 8.3 KDa, 11.3 KDa, 14.9 KDa, 25.2 KDa, 35.4 KDa, 49.3 KDa)可以减少MTEC细胞中纤维连接蛋白（Fn）或结缔组织生长因子（CTGF）的表达，维持MTEC细胞正常的上皮细胞形态，抑制TGF-β1诱导的EMT转化。褐藻多糖硫酸酯的相对分子量和其抗EMT活性之间的关系是非线性的。LHX 1(Mw=3.3 KDa), LHX 5 (Mw=11.3 KDa)和LHX 8 (Mw=35.4 KDa)可以同时下调Fn蛋白和CTGF蛋白的表达，表现出更优的抗EMT活性。

目 录

第一章 引 言.......................................................................... 1

1.1 海洋生物资源与海洋药物............................. 1

1.2 褐藻多糖硫酸酯的研究概况........................... 2

1.2.1 褐藻多糖硫酸酯的提取与降解工艺..................................... 3

1.2.2 褐藻多糖硫酸酯的多种肾脏保护活性................................. 3

1.2.3 褐藻多糖硫酸酯的结构与活性............................................. 8

1.3 肾纤维化与上皮间充质转分化......................... 9

1.4 选题意义与研究背景................................ 10

第二章 低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备及质量研究...... 13

2.1 仪器与材料........................................ 13

2.1.1 实验仪器............................................................................... 13

2.1.2 实验材料............................................................................... 13

2.1.3 实验试剂............................................................................... 14

2.2 实验方法.......................................... 15

2.2.1 单因素实验........................................................................... 15

2.2.2 降解工艺研究与优化........................................................... 16

2.2.3 生产工艺验证....................................................................... 17

2.2.4 化学分析方法....................................................................... 18

2.3 实验结果.......................................... 21

2.3.1 氧化降解法的实验指标对产物分子量的影响................... 21

2.3.2 降解工艺确定....................................................................... 22

2.3.3 化学成分分析....................................................................... 25

2.3.4 生产工艺验证结果............................................................... 25

2.4 讨论.............................................. 26

第三章 不同分子量褐藻多糖硫酸酯抑制MTEC细胞上皮间充质转分化的研究............................................................ 29

3.1 实验仪器与材料.................................... 29

3.1.1 实验仪器............................................................................... 29

3.1.2 实验材料............................................................................... 29

3.1.3 实验试剂............................................................................... 29

3.2 实验方法.......................................... 31

3.2.1 细胞毒性实验....................................................................... 31

3.2.2 TGF-β1有效浓度筛选.......................................................... 32

3.2.3 样品有效作用时间研究....................................................... 32

3.2.4 细胞免疫荧光实验............................................................... 32

3.2.5 Western Blot实验.................................................................. 33

3.3 实验结果.......................................... 36

3.3.1 细胞毒性实验....................................................................... 36

3.3.2 TGF-β1作用浓度的确定...................................................... 37

3.3.3. 样品作用不同时间后的细胞活力与细胞形态.................. 38

3.3.4 细胞免疫荧光结果............................................................... 41

3.3.5 蛋白免疫印迹结果............................................................... 43

3.4 讨论.............................................. 44

第四章 结论与创新点.......................................................... 47

4.1 结论.............................................. 47

4.2 创新点............................................ 47

参考文献................................................................................ 49

致 谢...................................................................................... 55

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果.... 57