胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）是一类具有分化全能性和无限增殖能力的特殊干细胞，可以在体外特定培养条件下诱导分化成为目标细胞，是细胞治疗的潜在细胞来源。体外ESCs的增殖、分化均与局部的物理与化学微环境相关，认识其特定的干性维持和定向分化规律，对于体外扩增和诱导分化具有重要的意义。本文采用力学-生物学、细胞生物学及力学-蛋白质组学等相结合的方法，对人胚胎干细胞（hESCs）H1/H9细胞系的干性维持和定向分化的力学-生物学耦合规律及机制进行研究。主要开展如下工作：

1、硅酸钙（calcium silicate, CS）浸提液对H9细胞的细胞毒性、干性维持及早期分化潜能的影响。探索有别于传统生化方法调控H9细胞干性和分化的简易方法是干细胞工程的重要途径。采用高（1/64）、低（1/256）两种浓度的CS浸提液（主要功能成分为硅离子）作用于H9细胞，对克隆铺展速度和铺展面积，凋亡细胞的比例及分布等指标进行检测。结果表明，不同浓度CS浸提液对H9细胞不但均未表现出明显细胞毒性，反而使克隆内细胞-细胞间产生更强的胞间相互作用。短时程培养条件下（3天），CS浸提液有利于H9细胞干性维持，而长时程培养条件下（6天）则驱动H9细胞分化。实验证实CS浸提液对H9细胞的作用具有双向调节：短时程时有利于H9细胞的干性维持；长时程又有利于H9细胞分化的启动。上述研究为采用无机硅离子调控H9细胞的干性或分化提供新的思路和方法。

2、多种力学刺激的多参数组合对H1细胞干性维持及早期分化潜能的影响。体内力学因素具有不同的类型、模式和参数，对细胞功能的影响远较体外单一力学刺激复杂。利用定量蛋白质组学方法，在拉伸、流动剪切和压缩三种力学刺激类型及不同加载模态和参数下，检测到共表达蛋白856种。聚类分析说明力学刺激类型对H1细胞影响最大。对于同类型力学刺激，不同参数及模态影响不同：拉伸组，时间>类型>频率；流体剪切组，时间>幅值>类型；压缩组，时间>幅值>频率。实验结果表明H1细胞在响应力学刺激时蛋白质表达变化具有力学种类及参数依赖性。采用Three Way ANOVA、GO、GSEA、WGCNA等方法对力学组学获取数据进行生物信息学分析，结果表明：拉伸条件下共得到37个模态敏感蛋白质、41个频率敏感蛋白质和23个时间敏感蛋白质；流体剪切条件下共得到13个模态敏感蛋白质、18个幅值敏感蛋白质和41个时间敏感蛋白质；压缩条件下得到4个幅值敏感蛋白质、183个时间敏感蛋白质。大部分力学差异表达蛋白质可跨细胞不同区域行使功能，细胞外到细胞质99种，细胞质到细胞核53种，从细胞外到细胞质再到细胞核110种。在所有的力学差异表达蛋白质中，拉伸组和流体剪切组共有的蛋白质是EXOSC5、MDC1、ACY1、STON2、BASP1，流体剪切组和压缩组共有的蛋白质是MTHFD1、GART，拉伸组和压缩组共有的蛋白质是UHRF1、RPL35A、HIST1H1B。拉伸组和流体剪切组及流体剪切组和压缩组均共有的关键枢纽蛋白分别是GART和EXCSC5。上述研究证实了力学刺激的不同类型、模态和参数协同影响H1细胞力学敏感蛋白的表达，为力学组学实验体系及分析方法的建立、干细胞力学-生物学耦合机制的研究提供方法参考、基础数据和下游研究思路。

3、胞间粘附对H1细胞干性维持及向定形内胚层（definitive endoderm, DE）分化的影响及调控规律。克隆内细胞-细胞间粘附是H1细胞维持干性和启动分化的关键物理作用、并与基质硬度协同调控其功能。实验结果表明，诱导H1细胞分化1天时硬基质（46.7 kPa）上分化的DE细胞比例显著高于其它二种较软基质（6.1 kPa、0.14 kPa）。分化1天或3天后，DE细胞标志物CXCR4的表达量随着基质硬度的增加而显著增加，说明硬基质更易于启动H1细胞的DE向分化并助其成熟。软胶（0.14 kPa）基质上H1克隆中细胞-细胞间E-cadherin和β-catenin的表达量显著高于其它两种基质，而阻断胞间粘附能够增加分化1天后DE细胞的比例，说明细胞间粘附不利于H1细胞的DE向分化。分化标志和力学敏感蛋白YAP的总量和核质比以及核区表达量，在DE分化1天和3天两个时间点均随着硬度的增加而增加。相关性分析表明YAP激活后的入核可正向调控CXCR4的表达。因此，硬基质通过引起YAP核转位进入细胞核来促进H1细胞定向分化为DE细胞，E-cadherin形成的胞间粘附能够结合YAP、拮抗其对DE向分化的正向调控作用。

综上，本文通过CS浸提液、不同力学刺激条件对H1/H9细胞命运决定的研究，发现了生化因子和物理力学因素对H1/H9细胞干性维持和早期分化的影响，揭示了E-cadherin介导的细胞间粘附可通过YAP信号通路调控H1细胞向DE细胞的定向分化，丰富了对H1细胞干性维持与定向分化的力学-生物学耦合机制的认识。