深海放线菌SCSIO T05中苯并氧氮杂酮和聚酮类化合物的挖掘及其生物合成研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 张春燕 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 鞠建华 |
| 关键词 | Rishirilides，Baeyer-Villiger氧化，基因挖掘，卤化酶，甲基转移酶 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 其他题名 | Exploration and biosynthesis of dibenzoxazepinones and polyketides from marine-derived Streptomyces olivaceus SCSIO T05 |
| 英文摘要 | 微生物来源的天然产物是一类结构多样的、生物学活性广泛的、重要的化合物，在医药、农业等领域上具有巨大的应用前景。单一的微生物全基因组中存在几十个可能的生物合成基因簇，远比微生物个体中发酵分离得到的次级代谢产物的种类多，证明了微生物具有生产多种次级代谢产物的潜力，但大多数基因簇处于“沉默”状态。因此，激活沉默基因簇，有利于挖掘微生物更多的活性物质。研究微生物次级代谢产物的生物合成过程，解析其中新颖的、关键的酶学机制，有利于进一步通过组合生物合成的方法获得更多活性更好、毒性更低的结构类似物、衍生物。 本研究以分离自印度洋深海底泥中一株次级代谢产物丰富的链霉菌Streptomyces olivaceus SCSIO T05为研究对象，通过全基因组测序获得该菌株的全基因组序列信息，进一步antiSMASH分析其包含的可能的生物合成基因簇。通过基因挖掘手段成功激活了9类基因簇产物，对其中5类产物进行了结构鉴定，并进一步研究了其中3类的生物合成。首先，我们从S. olivaceus SCSIO T05的发酵粗提物中分离到4个主要的、已知的、属于两类蒽环骨架的聚酮类化合物rishirilide B（1a）、rishirilide C（1b）、lupinacidin A（1c）和galvaquinone B（1d），同时鉴定了负责rishirilides的生物合成基因簇rsd。通过结构基因rsdK2的体内敲除实验、完整基因簇异源表达实验证明了单一的rsd基因簇负责两类蒽环骨架类化合物1a-1d的生物合成。13C同位素喂养实验显示，化合物1a-1c的生物合成过程中包含一个关键的Baeyer-Villiger（BV）氧化重排反应，两个荧光素酶家族的单加氧酶RsdO1、RsdO6和一个黄素辅因子还原组分RsdO2（flavin reductase）很可能催化该BV氧化重排反应，导致两类蒽环骨架的形成。对rsd基因簇的基因进行敲除，发现了其中3个正调控基因促进化合物1a-1d的生产；体内敲除MarR家族的调控基因rsdR4，对1a-1d的生产影响不明显，其中1c的产量稍微有所提高，尤其该突变株明显生产一个新的同系物1f，鉴定为新化合物lupinacidin D。体内敲除编码amidohydrolase的基因rsdH，化合物1a-1d的产量整体提高了4倍以上。其次，通过基因敲除的方法我们意外获得表型变化后的S. olivaceus SCSIO T05/DrsdO9突变株，激活了一个沉默的dibenzoxazepinone（DBP）生物合成基因簇myc，分离及鉴定到其基因簇产物mycemycin C（2d）和3个新的同系物mycemycins F-H（2a-2c）。通过体内基因敲除因回补、化学喂养、系统进化树分析、生物转化、体外酶反应和动力学表征等实验，验证了水杨酸和5-Cl-犬尿氨酸为其生物合成前体，解析了卤化酶MycO催化前体犬尿氨酸C-5卤化生成5-Cl-犬尿氨酸，卤化酶MycR催化mycemycin C（2d）的C-4位发生卤代后修饰，甲基转移酶MycB催化前体5-Cl-犬尿氨酸C-4位甲基化生成5-Cl-4-CH3-犬尿氨酸前体单元，甲基转移酶MycJ负责mycemycin C（2d）C-14位发生羧甲基化后修饰。再者，通过基因挖掘手段，我们不断阻断S. olivaceus SCSIO T05的主要代谢通路，自然激活其他次级代谢产物的代谢通路。我们从阻断3 类主要代谢产物（rishirilides等蒽环类化合物、xiamycins、lobophorins）的“三敲”突变株S. olivaceus SCSIO T05RXL中获得一类新的萘环类安莎霉素olimycin A（3a）和olimycin B（3b）。通过单晶衍射，获得olimycin A 的晶体结构，修正了该类化合物ε-内酰胺环中C-4的绝对构型。通过体内基因敲除实验，成功获得BV氧化反应的疑似中间体化合物3c、3d和3e。综上所述，本研究挖掘到S. olivaceus SCSIO T05中9类次级代谢产物，证明了基因挖掘是一种有效激活基因组中沉默基因簇的方法；鉴定了rishirilides生物合成基因簇，推测其生物合成途径中关键的BV氧化重排反应导致两类蒽环骨架的形成，为研究该BV氧化重排的酶学机制奠定基础；鉴定了mycemycins生物合成基因簇，阐明了其中4个酶修饰步骤，有利于后续利用组合生物合成手段生成更多的结构类似物、衍生物；修正了安莎霉素ε-内酰胺环中C-4的绝对构型，鉴定了olimycins的生物合成基因簇，为后续阐明其生物合成过程中重要的BV氧化、P450氧化的酶学机制奠定了基础。 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18141]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张春燕. 深海放线菌SCSIO T05中苯并氧氮杂酮和聚酮类化合物的挖掘及其生物合成研究[D]. 南海海洋研究所. 2019. |
入库方式： OAI收割
来源：南海海洋研究所
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