Pf丝状原噬菌体编码的基因的功能研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李阳梅 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 王晓雪 |
| 关键词 | 丝状噬菌体，Pf4，切离酶，毒素-抗毒素，海洋噬菌体 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 其他题名 | Function and Regulation of Pf filamentous prophage encoded genes |
| 英文摘要 | 噬菌体是专一感染细菌等微生物的病毒，与大多数能裂解杀死宿主的噬菌体不同，丝状噬菌体更倾向于与宿主合作，维持一种互惠互利的共生关系。宿主为丝状噬菌体提供能量和必要的酶来完成生活周期，而丝状噬菌体可以改变宿主的基因组成，赋予宿主新的功能和环境适应性。丝状噬菌体在自然界中分布广泛，在环境中分离的铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和海洋环境的弧菌中丰度较高，其中以P. aeruginosa PAO1中的Pf4噬菌体的功能研究最多，Pf4噬菌体整合在基因组中，以稳定的溶源状态存在，在生物被膜的培养过程中Pf4被激活并产生成熟的噬菌体颗粒，能帮助宿主形成结构更好微生物被膜。并且激活后的Pf4噬菌体能通过直接抑制动物体内的抗菌免疫系统来促进细菌感染发病。然而，目前关于Pf4的溶源-裂解转换调控机制尚不清楚，因此，本研究以Pf4噬菌体为主要研究对象，从它编码的功能基因：切离酶、毒素-抗毒素系统、次要衣壳蛋白三个方面探讨了噬菌体的激活机理，初步取得了以下研究结果：第一，本文发现并证实Pf噬菌体编码一个切离酶，它决定了Pf4的溶源-裂解转换。模式菌株PAO1和PA14中均整合了一个丝状原噬菌体，分别是Pf4和Pf5。我们在Pf4和Pf5原噬菌体中均发现并鉴定了一个切离酶基因，分别命名为xisF4和xisF5，XisF4和XisF5均能极大的促进噬菌体切离。通过生物信息学分析发现，XisF4和XisF5在Pf噬菌体中广泛存在，并且它们正好代表了两大类切离酶家族。在Pf4噬菌体中，XisF4能直接激活Pf4的复制基因PA0727的表达来促进Pf4的复制，进而促进Pf4噬菌体颗粒的形成。另外，xisF4的上游存在一个抑制基因pf4r，它能抑制Pf4噬菌体的激活。xisF4和pf4r的5’-UTR区相互重叠，转录方向相反，不仅能激活自身的转录，还能互相抑制彼此的转录。表明Pf4r和XisF4的平衡决定了Pf4的溶源-裂解状态的转换。另外，在ΔPf4的菌株过表达Pf4r能使Pf4的侵染效率显著降低，说明Pf4r是Pf4的溶源免疫蛋白。此外，我们还证实宿主编码的两个H-NS家族的蛋白MvaT和MvaU通过直接抑制xisF4的转录来协同抑制Pf4噬菌体粒子的产生。说明Pf4在宿主内同时受到自身和宿主编码的抑制蛋白的双重调控XisF4来维持Pf4的溶源循环。第二，本文发现Pf4编码的一对毒素-抗毒素系统phd-PA0729调控“超感染”噬菌体的形成。Pf4能在生物被膜的形成过程中生成“超感染”噬菌体，即该噬菌体能再次感染携带Pf4原噬菌体的PAO1野生菌株，而与之相近的噬菌体Pf5和Pf1则不能，通过预测分析比较其基因组，发现Pf4基因组编码除共有的核心基因组外，还有一对II型毒素-抗毒素系统phd-PA0729。通过实验验证发现，抗毒素Phd可以中和毒素PA0729的细胞毒性，两者共同转录，并且相互作用形成复合物，该复合物通过结合phd-PA0729的启动子区的一段反向重复序列（5’-AATTC(N)3GAATT-3’）来抑制自身的转录。进一步对Phd-PA0729的功能研究，发现敲除PA0729导致PAO1在生物被膜的培养过程中，Pf4被激活进行大量复制，同时产生的缺失PA0729的Pf4噬菌体颗粒可以感染PAO1野生型菌株，即该噬菌体具备“超感染”能力，并且，该噬菌体还能感染过表达抑制蛋白Pf4r菌株。说明phd-PA0729可以通过突破Pf4r的免疫作用来参与调控“超感染”噬菌体的形成。第三，本文发现并证实Pf噬菌体编码的次要衣壳蛋白能帮助宿主抵御“超感染”。缺失PA0729的Pf4噬菌体颗粒虽然可以感染携带着Pf4原噬菌体的PAO1野生型菌株，但其感染效率显著低于缺失完整Pf4原噬菌体的菌株，因此推测，Pf4中存在潜在的基因可以抑制噬菌体的“超感染”，上文提到，Pf4编码的抑制蛋白Pf4r可以抑制野生型Pf4噬菌体的感染但是不能抑制缺失PA0729的Pf4噬菌体，说明Pf4基因组中还存在其它基因帮助宿主抵抗噬菌体感染。首先，我们对Pf4编码的基因在ΔPf4菌株中逐个过表达来筛选潜在的目标，实验发现，野生型Pf4（Pf4wt）和缺失PA0729的Pf4（Pf4ΔPA0729）均不能感染过表达PA0721的菌株。通过与已知的M13丝状噬菌体进行比较基因组学分析，预测PA0721属于Pf4的次要衣壳蛋白，实验证实Pf4的确能组装到Pf4颗粒中，并且能定位在宿主PAO1的细胞膜内。利用噬菌体吸附实验发现，过表达PA0721能极大的抑制Pf4对宿主的吸附。Pf4进入PAO1菌株中，首先需要与细菌中的受体——四型菌毛（Type IV Pili）相互作用，实验发现，PA0721可以抑制由四型菌毛介导的蹭行运动（twitching motility），说明PA0721能通过抑制四型菌毛来抑制Pf4对宿主的吸附。进一步寻找PA0721与四型菌毛相互作用的靶标蛋白，发现PA0721可以特异的与PilJ相互作用。综上，PA0721做为Pf4的结构蛋白，整合在细胞膜上，作为蛋白标记来抑制外界的Pf4再次侵染。综上所述，本文在对Pf4噬菌体的研究中，首次发现并鉴定了丝状噬菌体编码的切离酶，通过直接促进噬菌体切离和激活噬菌体复制来控制噬菌体的裂解-溶源循环；Pf4编码的一对毒素-抗毒素系统参与Pf4“超感染”噬菌体的形成；此外，Pf4编码的次要衣壳蛋白能通过抑制四型菌毛来实现“超感染”排除。在此基础上，对从珊瑚中分离的多株海洋细菌的系统分析发现，只有一株珊瑚致病菌Vibrio coralliilyticus SCSIO43001的染色体中整合了一个丝状噬菌体Vf，它的核心基因组与在海洋中丰度较高的CTXφ丝状噬菌体相似，基因结构排列上与Pf4有一定的相似性，它不编码切离酶，推测Vf噬菌体的切离可能像CTXφ利用宿主因子XerCD来实现，而不是利用切离酶。Vf也不编码毒素-抗毒素系统，但含有与PA0721同源的衣壳蛋白，推测该同源蛋白也能抑制同种噬菌体的再次感染。总之，本文对Pf4模式噬菌体进行的系统研究为以后深入研究海洋来源的丝状噬菌体与宿主的相互作用奠定重要的科学基础。 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18156]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李阳梅. Pf丝状原噬菌体编码的基因的功能研究[D]. 南海海洋研究所. 2019. |
入库方式： OAI收割
来源：南海海洋研究所
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