凡纳滨对虾酸碱度胁迫转录组及关键功能基因研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李红梅 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 胡超群 |
| 关键词 | 凡纳滨对虾，转录组，pH应答，免疫因子，钠氢交换子 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 其他题名 | Transcriptome Analysis in Response to Acid/Alkaline Stress and Study of Key Functional Gene of Litopenaeus vannamei |
| 英文摘要 | 凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei，俗称南美白对虾），是一种具有重要商业价值的世界性养殖甲壳类动物，其产量占全球经济对虾产量的71%。养殖环境参数，如盐度、温度、酸碱度、氨氮和溶氧量等是决定养殖成败的关键因素。近年来已开展了多项关于环境胁迫因子对凡纳滨对虾作用的分子机制研究，然而关于酸碱度胁迫的分子机制研究较少，NCBI的GenBank序列数据库中酸碱度胁迫相关基因的信息也比较匮乏。凡纳滨对虾是盐碱地开发利用的重要水产养殖品种。关于该物种在高pH胁迫方面的适应机制知之甚少。在本研究中，我们对高pH胁迫（pH 9.3±0.1）下凡纳滨对虾鳃组织的转录组进行分析，结果发现环核苷酸Ca2+通道（CNGC-Ca2+）和patched 1（Ptc1）是cAMP信号通路（KO04024）中被注释最多的成分，表明CNGC-Ca2+和Ptc1可能是转导和维持高pH胁迫信号的候选基因。而免疫球蛋白超家族(IgSF)、热休克蛋白(HSP)、谷胱甘肽转移酶(GST)、原酚氧化酶/酚氧化酶（proPO/PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、抗脂多糖因子（ALF）和脂蛋白则是高pH胁迫下转录的主要免疫因子。为进一步检测中枢调控基因，构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络；结果表明，基因/蛋白“聚合酶（RNA） II （DNA定向）多肽A”（POLR2A）、“组蛋白乙酰转移酶p300”（EP300）和“热休克70kDa蛋白8”（HSPA8）是应对急性高pH胁迫的三大中枢调控基因；“热休克70kDa蛋白4”（HSPA4）、“FBJ小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物”（FOS）和“核波尔蛋白54kDa”（NUP54） 则是参与耐受高pH胁迫的三大中枢调控基因。在高pH胁迫下EP300-HSPA8和HSPA4-NUP54蛋白的相互作用最为显著；而HSP70家族基因可能在凡纳滨对虾高pH胁迫环境的适应中发挥重要作用。这些发现提供了对虾高pH环境胁迫下的分子和免疫基础，PPI网络的建设有利于揭示对虾响应非生物胁迫的中心控制基因，为进一步研究打下基础。生物体生存有最适的pH范围，超出这个范围，生物体的生命活动就会受到威胁，甚至造成大量死亡。为阐明基因表达与低pH胁迫的关系，我们对正常pH环境中培养的对虾和低pH环境中（pH= 6.8）培养的对虾进行了转录组测序。所有的转录本（transcripts）组装成83,673个非冗余的unigenes。在低pH值（pH= 6.8）胁迫后1 h，胁迫组（pH= 6.8）和正常对照（pH= 8.0）的差异表达基因（DEGs）有2,807个，胁迫后48h差异表达基因有4,269个（False Discovery Rate（FDR）<0.001，fold-change ≥1）。两组差异表达基因在功能上主要注释到膜组成、磷酸化、膜、运输及离子转移相关功能。在胁迫后1h组，大多数DEGs富集到与信号转导、传染病和细胞群相关的途径中。而在48h组，大多数DEGs富集到消化系统以及其他次级代谢产物的生物合成、运输、分解代谢和能量代谢途径。从中筛选出58个先前报道与渗透调节和酸碱平衡相关的DEGs。本研究提供了有关凡纳滨对虾短时间和稍长时间暴露在低pH环境下的差异表达基因的有价值信息。此外，本研究中获得的大量关于离子调节的转录本为研究虾的pH调节机制提供了坚实基础。进一步结合高通量测序结果，RACE、qRT-PCR和细胞内pH检测等技术对获得的感兴趣的差异表达基因——钠氢交换子（Na+/H+ exchanger，NHE）进行了克隆和功能评价。首先从低pH胁迫转录组中选择差异表达的凡纳滨对虾NHE基因序列， 对NHE全长cDNA进行了克隆。结果表明：LvNHE cDNA长3167bp，包含74bp的5'-非翻译区（UTR）和456bp的3'-UTR，以及一个2637bp的开放阅读框（ORF），共编码878个氨基酸。NHE具有11个推定的跨膜结构域和长的细胞质尾部。LvNHE在氨基酸水平上与榄绿青蟹（Scylla olivacea）NHE具有高度序列同源性。在凡纳滨对虾肝胰腺、鳃、眼柄、表皮、心脏、肠、肌肉、脑和胃中均能检测到LvNHE mRNA，其中肠道的表达丰度最高。将对虾肠碎片培养物暴露于逐渐下降的pH培养基中（从pH8.0至pH6.4），LvNHE mRNA表达被显著刺激，在pH7.0的培养基中孵育6h表达量最高。为了研究LvNHE在生理和细胞水平上的pH调节功能，通过siRNA方法使LvNHE mRNA表达沉默。经低pH攻击后，LvNHE mRNA沉默的虾的血淋巴pH值显著降低。此外，LvNHE mRNA干扰后降低了酸化后肠片段细胞内pH的恢复能力。这项研究证明了NHE基因在凡纳滨对虾低pH胁迫响应中的作用，为对虾的酸/碱稳态机制提供了新的见解。 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18160]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李红梅. 凡纳滨对虾酸碱度胁迫转录组及关键功能基因研究[D]. 南海海洋研究所. 2019. |
入库方式： OAI收割
来源：南海海洋研究所
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