香港牡蛎多倍体育种技术研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 秦艳平 |
| 答辩日期 | 2019 |
| 授予单位 | 南海海洋研究所 |
| 导师 | 喻子牛 |
| 关键词 | 香港牡蛎，多倍体，生长性状，品质，杂交 |
| 学位名称 | 博士 |
| 学位专业 | 海洋生物学 |
| 其他题名 | Research on polyploid breeding of the Hong Kong oysters, Crassostrea hongkongensis |
| 英文摘要 | 香港牡蛎是分布于我国华南地区的一种重要经济品种，2017年产量为176万吨，约占全国牡蛎产量的36.5%。但是和其他牡蛎品种类似，香港牡蛎在性腺繁殖期品质变差、生长减慢，这可能要归因于性腺的发育。香港牡蛎性腺发育是周期性的且至少需要2年才能达到上市规格。另外，性腺发育消耗大部分能量，导致牡蛎抗性降低、死亡率增高。解决这些问题的方法之一就是推广香港牡蛎三倍体的养殖。1. 五种诱导香港牡蛎三倍体方法的效果比较以卵裂率、D形幼虫发生率、三倍体率、存活率等为指标，比较了五种方法诱导香港牡蛎三倍体幼虫的效果，同时也分析了诱导因子强度（或浓度）、持续时间、受精卵密度及受精后开始处理时间对诱导效果的影响。结果表明，高盐诱导三倍体的最适条件组合是在卵子密度1.0×107 个/L的情况下受精后15 min，用盐度40的海水持续处理10 min，此时卵裂率为(39.60±2.14)%, D形幼虫发生率为(31.46±1.06)%，三倍体率可以达到(59.53±5.90)%。低温诱导三倍体的最适条件组合是密度为2.0×107 个/L的卵子在受精后15 min， 用10 ℃海水持续处理10 min，此时卵裂率为(21.00±4.90)%，D形幼虫发生率为(12.68±1.21)%，三倍体率为(51.09±2.67)%。咖啡因诱导三倍体的最适条件组合是卵子密度为1.0×108 个/L，用咖啡因终浓度2.0 g/L的海水在受精后15 min，持续处理20 min，三倍体率可以达到(56.36±2.07)%，卵裂率为(85.46±4.78)%，D形幼虫发生率为(71.79±3.92)%。受精卵密度为2.0×108个/L条件下，香港牡蛎受精15~18 min后，开始用浓度为0.5mg/L的CB处理，处理持续时间为20 min，是CB诱导香港牡蛎三倍体的最佳诱导组合，此条件下三倍体产率100%，卵裂率为53.16%~60.00%，D形幼虫孵化率为47.32%~53.09%，诱导效率指数为0.50，生产成本为260~390元/L。受精卵密度为4.5×107个/L的条件下，香港牡蛎受精15~18 min后，用浓度为75~100mg/L的6-DMAP处理，处理持续时间为20~25min，是6-DMAP诱导香港巨牡蛎的最佳诱导组合，此条件下三倍体率63.52%~72.36%，卵裂率为60.00%~66.25%，D形幼虫孵化率为74.43%~90.00%，诱导效率指数为0.56，生产成本为185元/L。最适诱导条件下，咖啡因的诱导效率指数0.405高于高盐处理0.187、低温处理0.065，且高盐及低温处理方法诱导出的幼虫三倍体率随生长降低极快且存活率低于咖啡因诱导方法。 CB诱导方法倍化率高、但D幼率较低、CB毒性大、价格昂贵、试剂成本高，而6-DMAP诱导方法虽倍化率较低、但是其D幼率更高、诱导效率更高、试剂成本低而且对实验人员健康影响较小、对环境污染较轻，所以6-DMAP诱导方法可能更加适合用于大规模的香港牡蛎三倍体苗种生产。本研究为香港牡蛎多倍体育种生产提供了理论基础与实践经验。2. 香港牡蛎二倍体与三倍体生长、存活比较及基因型与环境交互作用影响我们首次系统的研究了基因型(倍性)、环境及其交互作用对香港牡蛎直到市场规格的生长性状的影响。根据我们的实验结果，三倍体幼虫生长显著性快于二倍体(P < 0.05)，而香港牡蛎三倍体和二倍体幼虫的存活率没有显著性差异。在地点内，三倍体壳高显著性大于二倍体(P < 0.05)，而且在地点间，三倍体与二倍体的壳高也有显著性差异(P < 0.001)。另外，香港牡蛎全重在地点和倍性间有显著性差异(P < 0.001)，但是交互作用对其没有显著性影响。在第120天、第240天、第360天及第600天，香港牡蛎三倍体的边际存活率显著性高于二倍体，可能要归因于三倍体对于外界环境变化敏感性差且性腺育性较差。另外，香港牡蛎在地点间的存活率有显著性差异(P < 0.05)，预示着外部环境条件的变化对香港牡蛎的存活率有较大影响。在繁殖期，insulin通路各个基因在香港牡蛎二倍体中的表达量显著性高于三倍体(P < 0.05)，这和二倍体性腺及配子发育需要较多能量相关。而在非繁殖期，insulin通路的各个基因在香港牡蛎三倍体的表达量总体显著性高于二倍体，这为香港牡蛎三倍体快速生长提供了一种新的解释机制。总的来说，证明了香港牡蛎三倍体总体趋势上在生长、全重及存活率方面的优势，这也支持了香港牡蛎三倍体的大规模经济推广。3. 香港牡蛎四倍体诱导条件摸索及四倍体群系建立四倍体对于香港牡蛎全三倍体的大规模生产来说特别重要。成功诱导得到香港牡蛎四倍体需要对开始受精时间及处理时间进行精准控制。受精前，解剖的卵子的生发泡破裂率会明显影响四倍体的诱导率。根据我们的实验结果，如果生发泡破裂率在受精前达到100%可以显著性降低50%第一极体释放所需的时间(P < 0.05)。我们认为解剖的卵子在生发泡破裂率约100%时开始受精是最佳的时间点。50%第一极体释放是诱导香港牡蛎四倍体的一个非常重要的时间点。因为低盐(从15到25)及高温(从25℃到31℃)都会促进卵子生发泡的破裂及第一极体的释放，所以盐度15及温度31℃是诱导香港牡蛎四倍体的最佳的环境条件。在最佳环境条件下，我们发现香港牡蛎三倍体不同个体达到100%生发泡破裂及50%第一极体释放的时间幅度变化都显著性大于二倍体(P < 0.05)，这为通过混合不同三倍体个体的卵子诱导香港牡蛎四倍体的受精时间及处理持续时间的控制增加了难度。为了降低这个难度，我们建议在香港牡蛎四倍体诱导生产中最好采用单个三倍体个体进行。四倍体的诱导生产主要有三种方法：二倍体精子和卵子受精后一直第一极体的释放，三倍体雌性的卵子与二倍体雄性的精子受精后抑制第一极体或第二极体的释放。我们系统比较了3种方法诱导香港牡蛎四倍体的效果，首次发现三倍体雌性的卵子与二倍体雄性的精子受精后抑制第二极体是一种最好的诱导香港牡蛎四倍体的方法。通过这种方法，我们成功诱导得到了香港牡蛎四倍体并进行了自繁。4. 香港牡蛎二倍体与三倍体生化成分含量比较分析首次系统地比较了香港牡蛎二倍体及三倍体在生化成分及营养价值方面的差异。结果显示，在繁殖期，三倍体5种组织中（腮、外套膜、闭壳肌、唇瓣及性腺）糖原含量都显著性高于二倍体，三倍体优势率分别为96.26%, 60.17%, 72.59%, 53.56% 和128.52%。在非繁殖期，三倍体与二倍体糖原含量仅在腮和性腺中有显著性差异(P < 0.05)。在香港牡蛎二倍体及三倍体中，糖原合成酶基因(ChGS)和糖原磷酸化酶基因(ChGP)相对表达量分析和各组织中糖原含量变化相一致。另外，在繁殖期及非繁殖期，香港牡蛎三倍体必需氨基酸组成都比较均衡，这意味着蛋白含量不仅高而且质量好。令人意外的，在繁殖期及非繁殖期，香港牡蛎三倍体中α-亚麻酸、亚油酸、EPA和DHA等4中人体必需脂肪酸含量都显著性高于二倍体。另外，三倍体的n-3/n-6 多不饱和脂肪酸比例在两个时期都高于二倍体，说明三倍体具有更高的营养价值。生化成分的变化与柠檬酸合酶基因(ChCS)及α-酮戊二酸脱氢酶基因(ChKD)的表达量变化相一致，这两个酶基因是三羧酸循环的关键调控酶基因。总的来说，香港牡蛎三倍体比二倍体在糖原、脂肪及蛋白质含量方面有更好的口感和营养价值。5. 杂交二倍体及杂交三倍体生长、存活比较由于三倍体的育性较差，直接进行三倍体的遗传改良比较困难，但通过二倍体遗传改良是三倍体遗传改良的一种间接手段。本论文中，首次系统地比较研究了香港牡蛎、近江牡蛎、杂交二倍体及杂交三倍体在华南两个不同盐度点的情况。在浮游幼虫期，HA生长一直显著性高于HH及AA，自交组受精率显著性高于杂交组，且二倍体组D幼率显著性高于三倍体组；二倍体组存活率显著性高于三倍体组。在高盐养殖点，从第90天到第600天，HA壳高显著性高于HH；从第270天到第600天，HA壳高显著性高于AA；HA全重显著性大于HH及AA。在低盐养殖点，从第180天到第600天，HA壳高显著性大于AA，而只有在第600天，HA壳高显著性大于HH；在第360天和第480天，HA全重显著性大于AA；第600天，HA全重大于HH。高盐养殖点，HH边际存活率显著性低于其他三组；在第600天，HA、HHA边际存活率大于HH及AA。低盐养殖点，第360天，HHA边际存活率显著性大于其他三组；第600天，HH边际存活率显著性低于其他三组。杂交二倍体是完全可育的，HA性别比例和HH、AA没有显著性差异；HHA 52%~60%的个体可育，但可育个体育性较差。我们的研究首次证明了杂交二倍体及杂交三倍体的生长优势，为未来作为养殖新品种推广提供了基础。 |
| 源URL | [http://ir.scsio.ac.cn/handle/344004/18171]  |
| 专题 | 南海海洋研究所_学位论文（博士） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 秦艳平. 香港牡蛎多倍体育种技术研究[D]. 南海海洋研究所. 2019. |
入库方式： OAI收割
来源：南海海洋研究所
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