芜萍遗传转化体系的构建与鱼类致病弧菌蛋白抗原表达
文献类型：学位论文
| 作者 | PATHIRANAGE PRAJANI MAHESHA HEENATIGALA |
| 答辩日期 | 2018 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院水生生物研究所 |
| 导师 | 侯宏伟 |
| 英文摘要 | 芜萍属（Wolffia）隶属于浮萍科（Lemnaceae），是地球上最小的一类开花植物，其形态极度简化微缩，引起了许多生物学家，尤其是发育生物学家的广泛关注，也是一种潜在的生物反应器，用于表达具有重要商业价值的蛋白质。芜萍也是研究浮萍生理、生化和遗传特性等的理想模式生物。近年来也有学者将其用于开发生物能源和提取方面的研究。由于芜萍基因组复杂，缺乏成熟的瞬时转化和稳定转化体系，限制了它们在分子和发育等方面的研究。为此，本论文着力建立一套农杆菌介导的芜萍瞬时转化和稳定转化的新方法。为直观验证转化效果，我们向芜萍转入了两种能够启动GUS标记基因表达的合成启动子，构建了DR5::GUS和TCS::GUS 质粒载体，这两种质粒载体曾用于检测多种植物中生长素和细胞分裂素的分布。瞬时转化以芜萍的叶状体为材料，稳定转化则采用组织培养诱导出的簇状体（Clusters）为材料。将植物材料和玻璃珠(1 mm)混合后置于摇床中震荡从而使芜萍产生伤口，有助于转化，同时需与农杆菌菌株EHA105（或LBA4404）共培养。这两种农杆菌菌株含有能反映细胞分裂素分布的报告基因（TCS::GUS）构建或能反映生长素分布的报告基因（DR5::GUS）构建，两个构建均以双元表达载体pKGWFS7.0为骨架。实验采用G418筛选阳性转化株，G418的最佳筛选浓度为40 mg/L。将芜萍叶状体与玻璃珠一起强烈摇动、真空渗透，以及使用10 μM/L的乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS)是瞬时转化的必要条件。稳定转化时，需在农杆菌和芜萍簇状体共培养的过程中加入玻璃珠震荡，并静止培养14天后再筛选。最后，利用GUS染色和聚合酶链式反应（PCR和RT-PCR）来检验转化株系。所使用的两株农杆菌菌株中，EHA105更适于芜萍转化。实验获得的稳定转化效率为0.14%， 瞬时转化效率是21.8%。这两种转化效率可以满足基因功能研究的需求，可以用于芜萍的功能性遗传分析、遗传修饰和外源蛋白的工业化生产，其中稳定转化是国际上首次成功。斯里兰卡的海水养殖产业严重受到细菌感染的影响，成为制约该行业健康持续发展的主要因素之一。弧菌属是一种水生环境中普遍存在的革兰氏阴性喜盐菌，也是影响水产养殖的主要病原菌，其引起的疾病被称为弧菌病。因此，我们对斯里兰卡海水养殖中的致病菌进行了细菌学研究，确定了致病性弧菌物种的多样性，提出了合适的控制措施。首先对来自西部、西北部和东部省份鱼虾养殖场的水、沉积物和感染动物进行了弧菌筛查。使用含2% NaCl的TCBS培养基作为选择性培养基，从收集的样品中分离弧菌，检测池塘养殖系统的总弧菌数（TVC）。虾养殖池中弧菌总数为0至5×103 CFU/ml，鱼养殖池中为0至3×103 CFU/ml。两种养殖池中的TVC值都高于或接近上限（1000CFU / ml）。与虾养殖池相比，鱼养殖池情况相对较好。我们用常规方法对分离的弧菌进行了鉴定，记录了属于弧菌家族的205个菌株。其中，78株弧菌被鉴定为病原菌，能引起鱼虾病害，分属于5个致病性弧菌属，包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈氏弧菌、雀鲷弧菌。鱼虾养殖池中，最常见的是副溶血性弧菌，其次是溶藻弧菌。之后，对所有分离到的弧菌进行抗菌试验，采用了六种抗菌药物包括氨苄青霉素、庆大霉素、甲氧基四环素、氯霉素、甲氧苄氨嘧啶和卡那霉素。结果显示，所有分离菌株均表现出多重耐药性（MDR），即对四种以上抗癌药物耐药。分离菌株的多重耐药性（MAR）指数从0.166变化到1.4。从鱼塘和病鱼中分离出的弧菌只有3%，其MAR值小于0.2。但从虾池和病虾中分离的的弧菌分离株的MAR值均高于0.2，表明这些菌株来自大量使用抗生素区域，进一步表明，抗生素在控制斯里兰卡弧菌病方面受耐药菌株的影响，效果有限。因此，要维持水产养殖业可持续发展，迫切需要采用疫苗这种控制弧菌病的新方法，但由于病原体的多样性，针对弧菌病的疫苗开发进展缓慢，因此，开发针对弧菌病的、能够提供异源保护的通用疫苗迫在眉睫。 利用基因工程技术，植物可表达多种外源蛋白质，包括疫苗和其他药用蛋白。鉴于芜萍的遗传特性（无性繁殖快、个体微小等），该属被确定为表达药用蛋白的理想植物材料。弧菌的外膜蛋白（OMP）LamB已被鉴定为用于防治弧菌病中具有通用性的疫苗候选物。因此，我们采用建立的遗传转化方法，将编码致病性弧菌外膜蛋白LamB（Maltoporin）的基因转入芜萍，通过人工培养，表达致病性弧菌的外膜蛋白LamB（Maltoporin），探索开发针对弧菌病的可食用疫苗的可行性。我们首先将LamB基因从病原溶藻弧菌中扩增出来。在LamB基因5'端连接tCUP增强子和Pr1b信号肽的基因序列，同时在3'端连接亲和标签c-myc和内质网滞留信号肽KDEL的基因序列，以确保所表达的重组蛋白质分子保留在内质网以避免蛋白水解酶在细胞质中对表达产物的水解。我们还在上述DNA片段两端连接PstⅠ酶切位点和BamHⅠ酶切位点的基因序列，获得质粒pMYC9701中的限制性酶切位点，构建质粒载体，并将上述质粒转入根癌农杆菌EHA105中，再采用我们开发的稳定转化方案，将上述根癌农杆菌EHA105与由2,4-D和6-BA诱导的芜萍簇状体（clusters）共培养，建立了芜萍转LamB基因株系。再通过对LamB基因的PCR和反转录-PCR（RT-PCR），证实基因成功转入芜萍基因组并得到了转录。用鼠抗myc抗体对转基因芜萍蛋白提取物进行免疫印迹分析，确认了分子量为51-kDa重组LamB蛋白的表达，表明芜萍可以用于生物反应器表达LamB抗原蛋白。以上研究建立了W. globosa的遗传转化方法，并利用W. globosa表达了重组蛋白。为开发基于芜萍生物反应器的弧菌口服疫苗开辟了道路。这是首次在芜萍属植物中表达抗原疫苗。 |
| 语种 | 中文 |
| 源URL | [http://ir.ihb.ac.cn/handle/342005/38992]  |
| 专题 | 水生生物研究所_中科院水生所知识产出（2009年前）_学位论文 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | PATHIRANAGE PRAJANI MAHESHA HEENATIGALA. 芜萍遗传转化体系的构建与鱼类致病弧菌蛋白抗原表达[D]. 中国科学院水生生物研究所. 2018. |
入库方式： OAI收割
来源：水生生物研究所
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