毒品成瘾是困扰人类健康的重大社会问题，其致病机制研究是亟待解决的重大科学问题。研究表明，基因表达长期改变是成瘾长期性的重要基础。吗啡是阿片类毒品的典型代表，研究其机制将为临床治疗吗啡成瘾人群带来福音。我们前期的研究表明，吗啡能够诱导自噬发生。然而，吗啡能否诱导特异性的分子伴侣介导的自噬发生，目前还不清楚。Hsc70和Lamp2A是分子伴侣介导自噬的生物学标志物，对于吗啡成瘾动物和吗啡处理的细胞中这两个标记基因的检测，有望确认分子伴侣介导自噬是否参与吗啡成瘾。本研究中，我们通过Microarray芯片筛选，试图获得一批在吗啡成瘾的大鼠海马区表达长期改变的基因。结果显示，分子伴侣介导自噬的标记物Hsc70的mRNA表达水平显著上调。此外，Hspa1b、Stip1和Cryab这三个小分子伴侣的mRNA表达水平也升高。这个结果提示分子伴侣介导的自噬可能参与吗啡成瘾。进一步对于吗啡处理的小鼠海马、大鼠神经胶质瘤细胞C6和大鼠嗜铬瘤细胞PC12细胞进行检测Hsc70、Hspa1b、Stip和Cryab的表达变化。结果显示，分子伴侣介导的自噬的标记物HSC70和LAMP2A蛋白水平显著上调，表明吗啡诱导了分子伴侣介导的自噬发生。我们同时发现，Hspa1b基因的mRNA和蛋白表达水平在这些组织和细胞中显著上调，Stip1和Cryab基因mRNA水平也显著上调，但蛋白水平变化不显著。因此，我们选择Hspa1b基因进行深入研究，通过在细胞水平上过表达和敲除Hspa1b基因，来研究其对于吗啡诱导的分子伴侣介导的自噬的影响。我们采用目前最常用的基因编辑技术CRISPR/Cas9技术来实现Hspa1b基因的敲除。通过向导RNA识别目标DNA靶序列，Cas9蛋白联合crRNA和tracrRNA一起切割外源基因组DNA，可实现基因编辑。该过程具有高效、普适、简便、可操作性高以及精确打靶的优点。我们成功地构建和筛选了一株PC12细胞和四株C6细胞的Hspa1b敲除细胞系。其中，PC12基因敲除细胞包括Hspa1b-KO-28# (c. 207_208del)。C6基因敲除细胞系包括Hspa1b-KO-43# (c.213_214insA)、Hspa1b-KO-9# (c. 197_211del)、Hspa1b-KO-6# (c. 203_225del; c. 203_208del)和Hspa1b-KO-21# (c. 208_215del; c. 211del)。我们在这些Hspa1b敲除细胞系进行了一些功能探究。敲除Hspa1b基因后，HSC70和LAMP2A蛋白水平显著下调，表明分子伴侣介导自噬减弱。过表达Hspa1b基因后，HSC70和LAMP2A蛋白水平显著上调，结果表明分子伴侣介导自噬增强。综上所述，我们发现在吗啡成瘾大鼠和小鼠的海马组织以及细胞系中Hspa1b基因的转录及翻译水平都显著上调。同时，我们在吗啡成瘾大鼠海马和细胞系中发现分子伴侣介导的自噬发生增强。过表达Hspa1b增强分子伴侣介导的自噬和巨自噬，Hspa1b基因敲除细胞系中发现分子伴侣介导自噬减弱。这些结果表明Hspa1b参与到吗啡诱导的分子伴侣介导的自噬过程中。我们通过CRISPR/Cas9这种基因编辑技术构建的Hspa1b基因敲除细胞系，可为深入研究该基因在吗啡成瘾过程中的潜在作用提供基础。