随着科技的高速发展，新型化学品不断涌现，其大量生产与应用不可避免地会释放到环境中形成新的污染，从而构成对野生生物与人体的暴露风险。目前关于新型有机污染物的毒理学数据非常有限，其潜在的内分泌干扰效应或致癌效应的研究资料非常欠缺。SPAs是一类典型的新型有机酚类化合物，在生活中应用广泛，尤其是其作为食品添加剂的使用造成了人体的直接暴露，由此引发的健康风险值得关注。本论文一方面围绕合成酚类抗氧化剂（SPAs），在其内分泌干扰效应筛选的基础上，评价了这类化合物对斑马鱼胚胎的发育毒性效应与作用机制；另一方面，基于小鼠胚胎干细胞（mESCs）活体成瘤模型，构建了污染物诱导干细胞癌变的评价方法体系，可望用于新型有机化合物发育毒性与致癌效应中。

      现有毒理学数据显示，SPAs具有潜在的内分泌干扰效应，在不同的实验体系中可表现出类雌激素或抗雌激素效应，表明其毒理学作用非常复杂。本研究采用MVLN细胞荧光转录活性测试与Hithunter雌激素受体（ER）竞争性结合实验，筛选了包括3-叔丁基-4-羟基苯甲醚（3-BHA）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）和2,2’-亚甲基双（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（AO-2246）在内的四种SPAs与雌激素受体的结合作用，发现它们不具有或者仅有很弱的雌激素受体结合活力。基于H295R细胞类固醇激素生成实验发现，SPAs能显著诱导雌二醇（E2）的生成，其中3-BHA诱导E2生成的效应最为明显。进一步的分子机制研究发现，3-BHA通过调控蛋白激酶A（PKA）信号通路诱导类固醇激素合成相关基因如StAR、3βHSD、CYP11B1和CYP11B2的表达量上升，导致E2生成量显著上升。斑马鱼活体暴露实验表明，3-BHA可干扰下丘脑-垂体-性腺轴（HPG axis）相关基因表达，导致斑马鱼性腺中E2和睾酮（T）含量显著上升，从而很好验证了离体筛选实验显示的这类化合物具有类固醇激素合成干扰效应的研究结果。由于作为食品添加剂使用的BHA是两种同分异构体的混合物，化合物结构差异引起细胞效应差异的比较分析显示，作为添加剂主要成分的3-BHA是BHA干扰类固醇激素生成的主要因子，2-BHA暴露效应并不明显。以上研究表明，SPAs，特别是3-BHA，可有效干扰类固醇激素合成，具有明显的内分泌干扰效应，因此其作为食品添加剂的应用安全性值得深入关注，BHA同分异构体引起细胞效应差异的研究发现也为食品添加剂的优化选择提供了科学思路。

      现有研究显示，SPAs在地表水、地下水、城市污水等水环境介质中广泛存在，表明其水污染现象非常普遍，然而这种新型内分泌干扰物对水生生物可能产生的毒理学效应与暴露风险尚不明确。本研究采用斑马鱼胚胎-幼鱼发育毒性测试模型，研究了3-BHA、TBHQ、BHT和AO2246暴露的潜在发育毒性效应及作用机制。在斑马鱼胚胎受精后4小时（4 hpf）到120 hpf的暴露期间，3-BHA导致胚胎孵化率显著降低，造成幼鱼脊柱弯曲、鱼鳔充气缺陷、心率下降；TBHQ可导致胚胎孵化率显著降低，心率下降，幼鱼发育畸形如心包水肿、鱼鳔充气缺陷、色素累积异常、体长变短；BHT导致幼鱼心率显著下降、体长变短、鱼鳔充气缺陷、心包水肿；AO2246暴露引起幼鱼心率下降、心包水肿、鱼鳔充气缺陷。分子机制研究显示，四种SPAs可通过影响斑马鱼下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT axis）、GH/PRL的合成、hh信号通路相关基因的表达而产生发育毒性作用。为研究SPAs是否在胚胎器官形成期产生毒性效应，对10 hpf和24 hpf胚胎进行形态学和基因表达分析发现，3-BHA和TBHQ暴露诱导胚胎中细胞分化相关基因表达上调，从而引起胚胎发育延迟。该研究显示，四种SPAs水体暴露可对斑马鱼胚胎与卵黄鱼产生明显的发育毒性效应，为其水生毒理暴露风险评价提供了重要的科学数据。

      环境污染物的致癌效应是其毒理学效应研究的重中之重，胚胎干细胞活体成瘤模型为污染物发育毒性与致癌效应研究提供了全新的研究思路。本研究首先构建了mESCs在免疫缺陷小鼠体内形成畸胎瘤的实验模型，针对该模型构建过程中涉及的关键实验条件进行了优化。结果显示，干细胞的最佳接种密度为2×106个/100 μL/只，受试动物选用重度联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，接种位置为侧腹皮下，肿瘤开始形成时间为注射后12天左右。通过组织病理学检查对畸胎瘤进行详细的表征与鉴定，结果表明，形成的畸胎瘤具有典型的三胚层结构。

      在mESCs活体成瘤技术优化的基础上，通过对mESCs预先进行TCDD暴露48 h，表征暴露后的mESCs，并将其进行活体NOD/SCID小鼠皮下注射成瘤，28天后解剖形成的畸胎瘤组织进行表征，同时开展瘤组织的离体再培养分析。实验结果显示，0-500 nM TCDD暴露48 h并不干扰干mESCs的细胞活性与细胞周期，对照组与暴露组的细胞均呈克隆生长，碱性磷酸酶活性没有出现明显变化，表征干细胞多能性的分子指标（Oct4、Nanog、Sox2）也未发生显著改变。然而，TCDD暴露可显著诱导CYP1A1的表达上升，但对抑癌基因p53的表达未产生影响。针对活体成瘤过程的观察分析显示，尽管各组成瘤率相似，TCDD暴露的干细胞在小鼠皮下分化成瘤速度更快，形成的肿瘤组织更大、更重，并且多呈高度血管化的暗红色。组织病理学观察结果表明，对照组畸胎瘤组织出现典型的外胚层、中胚层与内胚层结构，而TCDD处理组的畸胎瘤除了这些典型的三胚层结构外，还出现细胞异型性改变和瘤巨细胞等典型的恶性肿瘤特征，表明癌变的发生。针对组织病理学的统计分析显示，对照组畸胎瘤没有癌变现象，而100 nM 与200 nM TCDD预处理引起mESCs活体成瘤恶变发生率分别增加至40%与50%。分化的畸胎瘤组织各胚层的分子标志物指标表达上升，而多能性分子指标下降。与对照组织相比，暴露组瘤组织中的CYP1A1、p53与CD44表达均相对较高，表明肿瘤发生恶变。对于畸胎瘤组织的离体再培养分析显示，对照组肿瘤细胞生长速度缓慢，很难开展进一步的传代培养，而TCDD暴露组的肿瘤细胞在离体再培养过程中生长较好，可形成未分化克隆样组织，细胞多能性（Oct4、Nanog）与恶变分子指标（CYP1A1、p53）表达均相对较高，表明这些离体细胞的恶性。以上研究开创性地建立了一种基于mESCs活体成瘤研究污染物致癌效应及其分子机制的新的评价方法体系，为探讨新型有机污染物的发育毒性与致癌效应提供了很好的研究思路与实验技术支持。

      基于mESCs的毒性测试实验可有效用于评价化合物的发育毒性研究，其在新型污染物毒性效应评价方面也有很好的应用前景。研究利用mESCs模型，通过初步探讨四种SPAs和三种PFIs的干细胞毒性效应发现，mESCs对化合物暴露可表现出灵敏有效的毒性响应。针对不同类型化合物的研究结果，与其它离体或活体实验结果具有相似性，也有与其他细胞模型研究结果不同的情况，表明了干细胞模型在毒理学测试中的普适性与独特性。以上工作为进一步深入开展具有内分泌干扰效应的新型有机污染物的发育毒性和致癌效应研究奠定了重要基础。

      本论文研究发现一方面为新型有机污染物的内分泌干扰效应筛选、发育毒性效应评估与致癌效应与机制研究提供了重要的实验方法体系，另一方面也揭示了新型污染物合成酚类抗氧化剂干扰类固醇激素合成产生内分泌干扰效应的毒性作用机制，以及经典污染物TCDD诱导干细胞癌变的分子生物学过程。本论文研究发现为新型环境污染物的毒理学效应与机制探讨提供了创新性研究思路。