全氟辛烷基磺酸（Perfluorooctane Sulfonates，PFOS）和全氟辛烷基羧酸（Perfluorooctanoic acid，PFOA）是两种生产和应用较为普遍的全氟化合物（PFCs），其在全球范围内的环境污染问题已经得到广泛关注。目前众多研究结果表明PFCs 主要毒性机制是由于其与脂肪酸相似的分子结构而发生与脂肪酸受体等蛋白的直接作用，可见PFCs 与胞内功能性蛋白的直接结合作用是其毒理机制中的重要环节，因此希望能够在细胞水平对与PFCs 发生结合作用的功能蛋白分子进行筛选，从而建立起一种普适的筛选PFCs 毒性作用靶标蛋白的方法。
本课题以PFOS 和PFOA 为主要研究污染物,拟将对细胞内蛋白质-污染物小分子复合物进行免疫共沉淀(Co-IP)实验和高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）技术联合应用，对人肝癌细胞HepG2 中PFCs 发挥毒性作用的靶标蛋白进行筛选。
      依据上述研究思路，我们首先建立了使用HPLC-MS/MS 技术对PFOA 和PFOS 的定量分析方法，使用内标法对PFOA 和PFOS 的检出限分别达到.1ng/mL和0.05ng/mL，其中PFOA 的线性检测范围为0.5-500ng/mL，PFOS 的线性检测范围为0.1-500ng/mL。在质谱样品制备时采用乙腈液-液萃取法和Oasis WAX SPE小柱对样品进行处理，对PFOA 和PFOS 的回收率分别达到118%和159%，满足定量分析方法的需求。
      随后选择了包括受体、酶、应激蛋白以及骨架蛋白四类功能性胞质蛋白在内的甲状腺激素受体（TR）、肝脏X 受体（LXR）、酪氨酸磷酸酶（SHP2）、热休克蛋白90（Hsp90）、热休克蛋白70（Hsp70）和肌动蛋白（β-actin）作为待选的PFOA/PFOS 作用蛋白。通过Western Blot 验证了六种蛋白在HepG2 细胞中的表达水平，并通过共价反应成功构建了分别可特异性捕获六种蛋白而达到较好免疫沉淀效果的免疫磁珠，可用于后续的Co-IP 实验。
      最后，为了避免在样品制备和Co-IP 实验过程中出现影响蛋白质-污染物小分子稳定性的问题，分别利用荧光偏振、流式检测、SDS-PAGE、Western Blot
几种技术，以及人血清白蛋白（HSA）和全氟癸酸（PFDA）-FITC、外源表达纯
化的甲状腺激素受体（His-TR）和甲状腺激素T3-FITC 两个蛋白质-小分子作用
体系，对细胞样品的Co-IP 实验条件进行深入探索和优化。结果表明，与裂解液
裂解细胞法相比，超声破碎细胞的方法对PFDA 结合HSA 的能力几乎没有影响，且获得的总蛋白量更高，不影响蛋白活性。多个结果联合验证50% Cocktail 是最
适于对模拟样品中His-TR 与T3-FITC 复合物进行Co-IP 的酶抑制剂条件，同时
非均相反应中的清洗操作程度对该复合物稳定性可能有较大影响。
      总之，对于细胞样品中蛋白质-污染物小分子复合物的Co-IP 实验条件虽尚未探索完全，但可以确定细胞裂解液制备方法、酶抑制剂添加情况、由均相转为非均相的过程以及对磁珠的清洗程度等几类实验条件极为重要，在后续实验中应继续关注和探索，有望最终成功建立Co-IP 联合HPLC-MS/MS 对实际细胞样品中可与污染物结合的蛋白分子进行简便快速高通量筛选的普适性方法。