纳米银作为一种广谱的抗菌试剂，已被广泛地应用于个人护理产品、保健品以及医疗用品等诸多领域。然而，纳米银在这些产品的生产、使用和处置过程中，会不可避免地释放到环境当中，对环境生物和人体健康造成潜在的威胁。因此，纳米银所引发的健康效应正引起人们的关注。纳米银在释放进入环境以及生物体之后，会发生不同的物理、化学和生物转化，其高度动态性导致不同形态的银共存于环境以及生物体内。尽管不同形态银所诱导的毒性与其形态密切相关，但对于不同形态银的毒性效应与机制研究依旧面临挑战，主要原因是缺乏合适的分析方法来定量甄别生物基质中不同形态银。因此，发展在复杂生物基质中不同形态银的分离定量方法对于研究其在体内的生物分布及代谢转化行为具有十分重要的意义。此外，结合传统的毒理学分析手段，将银的转化行为与相应的毒性联系起来，可为深入探究并阐释不同形态银所诱导的毒性效应机制以及科学地评价其生物安全性提供可靠的数据和技术支持。
      本文主要研究不同形态银在环境生物体以及高等动物体内的分离定量、生物分布、代谢转化以及毒性效应。建立了基于四甲基氢氧化铵（TMAH）的生物基质消解的不同形态银提取的方法，并将其与尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体质谱（SEC-ICP-MS）在线联用的粒径分离和定量测定技术相结合，发展了细菌微生物和大鼠体内不同形态银的分离、浓度定量和形态表征方法；基于所建立的分析方法，研究了不同形态银的生物分布及代谢转化过程；结合传统的毒理学分析手段，将不同形态银的分布、转化行为与其毒性相结合，探究了不同形态银所诱导的毒性效应机制。本文主要包括以下几部分研究内容：
      首先，基于SEC-ICP-MS技术，建立了大肠杆菌细胞内颗粒态银、络合态银离子以及自由态银离子等不同形态银的分离和定量方法。为了完全排除细胞壁所吸附的银对内化进入细胞的银的测定的干扰，使用溶菌酶去除细胞壁以得到大肠杆菌的原生质体细胞；之后在破碎的细胞中立即加入表面活性剂FL-70以稳定纳米银的形态，再加入四甲基氢氧化铵（TMAH）进行细菌细胞的消解以及不同形态银的提取；最后利用SEC-ICP-MS实现大肠杆菌中不同形态银的分离和定量。本方法对于银离子以及不同粒径纳米银（10 nm, 20 nm和30 nm）均有较低的检出限（3 ng/mL）；通过大肠杆菌的三个水平加标实验表明，对于不同形态银的方法加标回收率为82.19%-115.8%，SEC分离保留时间的相对标准偏差< 0.9%，说明本方法适用于大肠杆菌内部不同形态银的分离定量。此外，研究发现银离子在大肠杆菌内以银离子-生物分子络合物的形式存在，但在一定量（107 CFU/mL）的大肠杆菌中，有限的生物分子数量使得络合态银离子的浓度存在上限（2 μg/mL），超过此上限的银离子则以自由态形式存在。本方法为细菌中银的形态分布和代谢转化研究提供了有效的分析方法。
      其次，本文研究了不同形态银在细菌中的转化行为及毒性效应。利用菌落计数法测得10 nm、30 nm纳米银和银离子对大肠杆菌的EC10、EC50和EC90值；在此暴露剂量下，基于前期所建立的细菌中不同形态银的分离、定量方法测定了大肠杆菌内部的银形态和含量；同时，基于SEC-ICP-MS能够测定细胞外培养基中不同形态银的含量；因此，利用差减法可以得到结合在细菌细胞壁表面的银含量，进而得出不同形态银的生物分布。研究发现，不同形态的银在大肠杆菌中的生物分布规律基本类似，少量的银（占总暴露量5.98%-15.21%）被大肠杆菌内化，而25.13%-64.43%的银锚定在细菌细胞壁，说明不同形态银同时存在细胞壁的锚定以及内化进入细胞内部的过程。此外，通过暴露不同粒径纳米银，发现了纳米银被细菌内化并发生溶解的单向过程，并且粒径越小，氧化溶解程度越高。与银离子暴露组相比，尽管纳米银暴露组（10 nm、30 nm）中细胞内部的溶解态银离子含量均更高，但细菌致死量却相同，说明由纳米银溶解释放出的银离子对于细菌的毒性作用低于最初暴露的自由态银离子。这可能是由于纳米银溶解释放的银离子与生物分子络合而导致的解毒效应。研究还发现，在实际环境条件下，大肠杆菌体内不容易出现自由态银离子。
      论文的第三部分建立了动物体内不同器官中不同形态银的分离、质量浓度定量和粒径表征方法。首先利用TMAH对猪肝进行消解及不同形态银的提取，先后优化了消解时间和消解浓度，将组织器官中的颗粒态和离子态银以其原始形态同时提取出来，最后基于SEC-ICP-MS进行分离测定。研究发现，进入生物基质中的纳米银表面会包裹一层生物分子冠（biomolecule corona, BCs），形成核壳结构AgNP@BCs。用ICP-MS进行银浓度定量时的检出限为0.1 μg/g，基于SEC色谱分离的保留时间可以测定组织中AgNP@BCs的有效粒径，且粒径分辨率为0.6-3.3 nm。更为重要的是，研究发现AgNP@BCs表面的BCs厚度与纳米银核粒径大小无关，且在组织样品中AgNP@BCs的有效粒径与核粒径呈线性关系，据此可以校正生物组织中纳米银的实际核粒径（标准偏差为0.2-1.1 nm）。本方法也可扩展到大鼠的其他器官（心、脾、肺、肾、脑）的分析，实现了大鼠不同器官中不同形态银的分离定量以及有效粒径/核粒径的测定。
      论文的第四部分研究了不同形态银在大鼠体内的生物分布、转化和毒性的联合效应。通过给大鼠尾静脉注射银离子（5 mg Ag/kg）、纳米银（5 mg Ag/kg, 20 nm）或银离子与纳米银的混合物（各5 mg Ag/kg），借助于已建立的生物组织中不同形态银的分离、浓度和粒径的定量表征方法，测定大鼠体内不同形态银的浓度和粒径分布，并将银的生物分布与组织病理学分析、血清生化指标与免疫组织化学分析相结合来描述颗粒态与离子态银的联合效应。研究发现，在大鼠器官中累积的银大多数都是以离子的形式存在，只有一小部分纳米银在肝脏和肺中检出，被器官摄取的纳米银一旦开始溶解，则会在短时间内完全溶解；尚未开始溶解的部分则在暴露后的3天内维持其原始粒径，到第5天时所有纳米银已经完全转化为银离子。尽管不同形态银在生物摄取和再分配方面的联合效应不明显，但在转化行为方面，生物体内共存的银离子能够加速所暴露的纳米银的溶解，可能由于金属硫蛋白的显著过量表达所致；此外，共存的纳米银在一定程度上能够缓解银离子所诱导的急性毒性。