作为重要的传统中药材之一，丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的市场需求量
逐年递增，同时作为“模式药用植物”，其次生代谢调控受到了广泛的关注。丹参
干燥根中丹参酮类与酚酸类成分的含量是评价药材品质的重要指标。因此，研究 其有效成分的代谢调控机制具有着重要的意义。赤霉素（GA）在调控植物生长与 发育过程发挥着十分重要的作用，虽然有研究表明 GA 处理可以显著提高丹参毛 状根中丹参酮类与酚酸类的含量，但其调控机制并不清楚。植物特有的 GRAS 蛋 白家族作为 GA 信号通路的关键调控因子，已被报道参与调控了 GA 信号通路、
根的生长发育和抗逆等很多生物过程，但其在次生代谢调控中的作用仍不清楚。 因此，本研究以丹参毛状根为材料，分析了5个SmGRAS基因对丹参毛状根生长， 以及丹参酮、酚酸类和 GA 物质合成过程中的调控作用，并进一步分析了其促进 丹参酮合成的调控机制。得到以下主要结果： 1. 分析了 GA 处理野生型丹参毛状根后，毛状根的干鲜重、丹参酮类、酚酸 类物质含量均显著升高。对 GA 处理的毛状根与对照组进行转录组分析，发现 GA 主要调控了次生代谢过程，Mapman 对次生代谢路径差异基因进一步深入分析表 明，次生代谢合成路径的差异基因大部分是 GA 诱导的，尤其是莽草酸途径、MVA 途径、酚类、甜菜碱类、蜡质和花青素类代谢途径。还分析了 GA 信号通路中的 差异基因，发现 GA 受体 GID1 与部分 SmGRAS 家族基因表达水平都发生了显著 的升高。 2. 全基因组鉴定了35个SmGRASs家族基因，并对其进行了生物信息学分析。 系统进化树分析显示 SmGRASs 家族蛋白聚为 10 个亚家族。氨基酸序列比对显示 35 个 SmGRASs 蛋白均具有保守的 GRAS 结构域，但不同亚家族的 SmGRASs 蛋 白具有不同的基序，因此可能发挥着不同的功能。进一步分析了 35 个 SmGRASs 基因的结构组成和理化性质。另外，转录组数据的筛选结果发现大部分 SmGRASs 的转录水平受到 GA 的显著影响。 3. 在丹参毛状根中筛选并克隆了 5 个对 GA 响应显著的 SmGRAS 基因，分析 了 SmGRAS1~5 的组织特异性表达模式，发现他们在根周皮的表达量是最高的， 在其他部位的表达略有差异。烟草原生质体的亚细胞定位显示 SmGRAS1~5 蛋白
定位在细胞核，可能作为转录因子行使调控功能。转录自激活实验表明SmGRAS1/3 具有转录自激活活性，SmGRAS2/4/5 则不具有。SmGRAS1~5 的启动 子元件分析发现它们都含有 GA 响应元件，还有其他激素（ABA、MeJA 和 Aux）、 光响应与非生物胁迫的响应元件。在 GA、MeJA、ABA、NAA 和 SA 处理下，大 部分的 SmGRAS1~5 的表达量均有显著的变化，但在时间和趋势上略有差异，表 明其在激素信号通路中具有不同的功能。 4. 分别获得 SmGRAS1~5 的过表达与反义表达毛状根，发现 SmGRAS1~5 的
过表达毛状根出现了生长受抑制的情况，其干鲜重均显著降低。分别过表达 SmGRAS1~5 可以显著提高丹参酮类的含量，降低 GA 的含量。但是对酚酸类的调 控是不同的，过表达 SmGRAS1/2/3/5 降低了酚酸的含量，而过表达 SmGRAS4 提 高了酚酸的含量。SmGRAS1~5 反义表达株系中的成分变化趋势与过表达株系中相 反。进一步分析丹参酮、GA 和酚酸合成路径基因的表达，结果显示大部分基因
表达量的变化与成分含量结果相一致，其中丹参酮合成路径下游合成酶基因 SmKSL1 的变化是最显著的，其次还有 SmCPS1。 5. 酵母单杂交结果显示 SmGRAS1/3/4/5 可以与 SmKSL1 启动子区域结合， EMSA实验进一步证明SmGRAS1/3/4/5可以与SmKSL1启动子区域的GARE-motif 元件结合。Dual-LUC 实验表明，SmGRAS1/3/4/5 可以激活 SmKSL1 启动子的表 达，说明 SmGRAS1/3/4/5 可以通过直接激活丹参酮合成路径下游关键酶基因 SmKSL1 的表达，从而促进丹参酮的合成。 本研究发现了 SmGRAS1~5 在调控丹参毛状根生长与调控丹参酮、GA 与酚
酸类合成过程中的作用，并分析了它们的生物信息学、表达模式、诱导表达、靶 基因的互作等功能。