凡纳滨对虾是我国乃至世界的主导对虾养殖品种，在对虾养殖业中占有十分重要的地位，然而随着养殖环境的恶化，病害频发问题已经成为限制产业健康可持续发展的最大障碍。由带有毒性质粒的副溶血弧菌引发的急性肝胰腺坏死综合征（AHPNS）自2013年爆发以来，给对虾养殖业造成了巨大经济损失。解决病害问题的根本途径是培育抗病品种，分子育种被认为是加快抗病品种培育的最有效途径，而鉴定抗病性状的关键基因及分子标记是开展分子育种的基础。本论文旨在建立一种适用于凡纳滨对虾等水产经济物种的高通量候选基因关联分析方法，并应用于抗病标记的筛选。本研究首次将三代靶向测序技术应用于对虾候选基因的分型，通过对对虾抗菌免疫相关的重要基因ALFs和PI3K进行精确基因分型，以及与抗弧菌性状进行关联分析，不仅证实了高通量基因分型技术的可行性与准确性，也发掘了一批与抗弧菌性状显著相关的SNP位点，可用于指导对虾抗弧菌性状的遗传选育。主要进展如下：

1、对虾候选基因高通量分型技术的建立：依据构建PacBio SMRT三代测序文库所需的样品要求，采用两步法PCR的方式进行扩增子制备，通过灰度法衡量扩增子DNA浓度进行等摩尔混样建库，构建了与三代测序结果更加适配的数据分析流程。进一步通过数据拆分、参考基因组比对、变异调用、单倍型构建与二次变异调用等流程，获得了2,416,000条测序reads，共1387个多态性位点，平均突变频率67 SNPs/kb，InDel类型突变有332个，并鉴定了9个结构变异（> 50 bp）。通过测序数据质量分析发现，99.89%的扩增子的位点测序质量在Q30以上，平均测序深度达22,000X以上，均满足了变异挖掘的要求，同时说明了测序数据的准确性和该基因分型策略与流程的可信度。

2、对虾ALFs基因内与抗副溶血弧菌性状相关SNP标记的筛选：以本实验室培育的“广泰1号”多家系种质库个体为材料进行了副溶血弧菌感染实验，取最初死亡的96尾凡纳滨对虾作为敏感群体，最后存活的96尾虾作为抗性群体，对候选基因LvALF1、2、4、5、6、7以及LvALF8在实验群体内进行扩增，并通过三代测序技术对候选基因进行了基因分型，开展抗弧菌性状相关位点的发掘。在以上7个候选基因中，共得到984个可信度高的多态性位点（MAF > 0.01）, 通过关联分析，在LvALF1、LvALF6、LvALF7及LvALF8中分别发现了1个、39个、40个及11个与抗弧菌性状显著相关的SNP标记（p < 0.05）,其中候选基因LvALF6 的位点ALF6-2_1277_A/G 、ALF6-2_1291_A/AG 及ALF6-2_3065_A/T，以及LvALF7的位点ALF7_3203_A/G与抗弧菌性状极显著相关（p < 0.01）。对所有标记进行单倍型预测，发现LvALF6的单倍型Block5（ATG/CCG）、LvALF7的单倍型Block1（AC）以及LvALF8的单倍型Block1（CGC）等共25个单倍型均与抗弧菌性状显著相关（p < 0.05）。

3、对虾PI3K基因内与抗副溶血弧菌性状相关SNP标记的筛选：使用三代测序技术对重要免疫基因LvPI3K的基因组序列（7378 bp）开展了变异挖掘和与抗弧菌性状的关联分析，共发掘到91个可信度高的SNP位点，通过关联分析鉴定到21个与抗弧菌性状显著相关的标记（p < 0.05），以及5个与抗弧菌性状显著相关的单倍型，其中位点PI3K_5366_T/C和PI3K_2205_GC/G与抗弧菌性状极显著相关（p < 0.01）。进一步利用Sanger测序在验证群体中证实了三代靶向测序技术分型结果的可靠性。

总之，本论文所建立的基于三代测序的靶向分型方法为凡纳滨对虾等水产动物提供了一种高效、低成本的基因分型方法，所发掘的抗弧菌性状相关位点对开展凡纳滨对虾抗弧菌性状分子育种具有一定指导意义。