肌肉是由肌细胞经历发育分化、融合为成熟的肌纤维及肌纤维生长等过程发育而来，这些过程受到多种基因的调控。Shisa蛋白家族是近年来发现的一类含有N端半胱氨酸结构域和C端脯氨酸区的单跨膜衔接蛋白家族，在脊椎动物的发育、癌症的产生和细胞凋亡中发挥重要的作用。shisa-2的表达在鱼类胚胎中具有体节特异性，同时体节是形成肌肉的基础，然而shisa-2在鱼类肌肉生长发育中的功能尚不清楚。

本研究以具有重要经济价值的海水养殖鱼类牙鲆（Paralichthys olivaceus）和模式生物斑马鱼（Danio rerio）为研究对象，克隆获得了牙鲆和斑马鱼的shisa-2基因，并对其所编码的氨基酸序列进行了分析；通过原位杂交和RT-PCR分析了基因在牙鲆和斑马鱼胚胎期的时空表达特点，同时利用qPCR分析了基因在牙鲆二、三倍体胚胎中的表达差异；通过细胞转染的方法，分析了蛋白的亚细胞定位；通过在牙鲆和斑马鱼胚胎中注射mRNA的方法进行基因的瞬时过表达研究，分析了其对肌肉发育标志因子myod表达的影响；构建了肌肉特异启动子驱动的表达载体，期望获得持续过表达的转基因斑马鱼，从而分析过表达shisa-2对肌肉发育的影响；在牙鲆和斑马鱼中进行了基因编辑实验，期望获得shisa-2突变体并分析基因的缺失对肌肉发育的影响。相关研究结果将丰富鱼类肌肉发育和调控机制的理论，为牙鲆等经济鱼类养殖提供参考。

1.  从牙鲆和斑马鱼中克隆得到shisa-2序列，对氨基酸序列进行分析发现，牙鲆和斑马鱼Shisa-2 都具有一个N端的信号肽区域、富含半胱氨酸结构域、跨膜区和脯氨酸区域。通过构建系统发育进化树发现，牙鲆Shisa-2与罗非鱼、金头鲷的聚在一起，而斑马鱼Shisa-2与鲤鱼的聚在一起。  

2.  RT-PCR分析表明，牙鲆shisa-2在未受精卵中有微弱表达，在原肠期之后，随着肌节的形成，shisa-2的表达量逐渐增加；原位杂交显示shisa-2 表达在体节中，同时表达在早期脑泡、视泡、耳囊、鳃弓中。在斑马鱼胚胎中，在原肠期以后，其在逐渐发育形成的前体节中胚层中表达量较高，在早期脑泡、视泡、耳囊中也表达。这些结果表明shisa-2在牙鲆和斑马鱼中有着体节特异性的表达特征，可能参与了肌肉发育过程的调控。

3.  在牙鲆和斑马鱼中对shisa-2的功能做了初步探究。将构建的重组表达载体pEGFP- N1- shisa-2转染到Hela细胞中，结果显示Shisa-2 蛋白定位在细胞内质网上。在瞬时过表达shisa-2的牙鲆和斑马鱼胚胎中，通过原位杂交发现肌肉特异因子myod的表达受到影响。通过CRISPR/Cas9技术对牙鲆和斑马鱼的shisa-2 进行敲除，免疫组化分析牙鲆F0代杂合突变体肌纤维融合及体节形态的情况，结果显示其体节形态出现异常。在斑马鱼中筛选获得了shisa-2 敲除的F1代杂合突变体。同时，将构建的肌肉特异性启动子驱动表达shisa-2的载体与Tol2转座酶共注射到斑马鱼胚胎中，经筛选得到了F1代转基因shisa-2斑马鱼。

第1章  引言... 1

1.1  肌肉的生长发育及功能... 1

1.1.1  骨骼肌的结构与功能... 1

1.1.2  鱼类肌肉的生长方式... 2

1.1.3  相关基因及信号通路在肌肉发育中的作用... 2

1.1.4  鱼类二、三倍体肌肉相关基因比较的研究... 4

1.2  内质网在肌肉发育中的作用... 4

1.2.1  内质网的结构与功能... 4

1.2.2  内质网在肌肉发育中的作用... 5

1.3  Shisa家族基因... 7

1.3.1  Shisa蛋白的结构... 7

1.3.2  shisa 基因的功能... 7

1.3.3  Shisa蛋白的作用机制... 8

1.3.4  shisa-2 研究进展... 9

1.4  立项依据和目的意义... 9

第2章 牙鲆和斑马鱼shisa-2基因的克隆及表达分析... 11

2.1  实验材料与方法... 11

2.1.1  实验材料与样品的获取... 11

2.1.2  主要试剂... 12

2.1.3  主要仪器设备... 12

2.1.4  实验方法... 13

2.1.4.1  总RNA 的提取... 13

2.1.4.2  DNase 消化总RNA.. 13

2.1.4.3  cDNA 第一条链的合成... 14

2.1.4.4  shisa-2 基因的克隆... 14

2.1.4.5  RT-PCR.. 16

2.1.4.6  整胚原位杂交... 17

2.1.4.7  绝对定量表达分析... 20

2.1.4.8  shisa-2系统发育进化分析... 21

2.2  结果        22

2.2.1  牙鲆和斑马鱼shisa-2 基因的克隆与序列分析... 22

2.2.2  牙鲆shisa-2 基因在胚胎发育各时期的时空表达... 25

2.2.3  斑马鱼shisa-2 基因在胚胎发育各时期的时空表达... 27

2.2.4  二、三倍体牙鲆中shisa-2 的表达量差异... 29

2.3  讨论        31

2.3.1  牙鲆和斑马鱼shisa-2 基因序列特征分析... 31

2.3.2  牙鲆和斑马鱼shisa-2 基因在胚胎发育过程中的表达... 31

2.3.3  shisa-2在二、三倍体牙鲆中的表达差异分析... 33

第3章 牙鲆和斑马鱼shisa-2 基因功能的初步分析... 35

3.1  实验材料及方法... 35

3.1.1  实验材料... 35

3.1.2  主要试剂... 35

3.1.3  主要仪器设备... 35

3.1.4  实验方法... 36

3.1.4.1  Shisa-2 蛋白的亚细胞定位... 36

3.1.4.2  shisa-2 mRNA过表达实验... 40

3.1.4.3  牙鲆shisa-2基因敲除实验... 43

3.1.4.4  转基因shisa-2斑马鱼的构建... 49

3.2  实验结果... 53

3.2.1  基因组验证... 53

3.2.2  Shisa-2 蛋白的亚细胞定位... 54

3.2.3  牙鲆胚胎中过表达shisa-2 对myod表达的影响... 55

3.2.4  斑马鱼胚胎中过表达shisa-2 对myod表达的影响... 56

3.2.5  牙鲆shisa-2 突变体的筛选... 57

3.2.6  斑马鱼shisa-2 突变体的筛选... 60

3.2.7  牙鲆shisa-2杂合突变个体肌纤维形态... 63

3.2.8  转基因shisa-2斑马鱼的筛选... 66

3.3 讨论        67

3.3.1  Shisa 蛋白的亚细胞定位... 67

3.3.2  shisa-2 基因对体节及肌肉发育的影响... 68

总 结... 70

参考文献... 71

致  谢... 71

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果    80