凡纳滨对虾胰岛素信号通路相关基因鉴定及其对生长影响的初步研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 逄颖
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| 答辩日期 | 2021-05-20 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 中国科学院海洋研究所 |
| 导师 | 张晓军研究员 |
| 关键词 | 凡纳滨对虾 胰岛素信号通路 基因 生长 蜕皮 |
| 学位名称 | 工程硕士 |
| 学位专业 | 生物工程 |
| 英文摘要 | 胰岛素信号（insulin/IGF signaling，IIS）通路在有机体的生长、发育、代谢、繁殖和寿命等生命活动中发挥着重要作用。本研究通过对凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）基因组和转录组数据进行分析，筛选得到凡纳滨对虾IGFBP、IR、ALS、GSK3、FoxO等一系列IIS通路相关基因序列，证明在凡纳滨对虾体内可能存在一条与脊椎动物类似的IIS信号通路，在对虾生长、发育、代谢、存活等方面发挥重要的调控作用。由于甲壳动物与脊椎动物在生理功能上差异较大，且缺少模式生物，导致关于甲壳动物IIS通路构成和作用机制方面的研究非常缺乏。凡纳滨对虾作为最重要的海水养殖物种之一，其生长性状令人关注。本研究针对对虾IIS通路相关基因，运用生物信息学方法分析相关基因的结构特点、系统进化和表达特征，同时采用活体实验方法验证其在生长方面的功能。本研究结果为阐明IIS通路相关基因对对虾生长的作用，及培育优良品种提供了理论基础，同时为深入研究甲壳动物IIS通路提供了新的线索。论文主要包括以下两个方面： 对虾IIS通路相关基因的结构和表达分析 运用生物信息学方法从凡纳滨对虾基因组和转录组数据中筛选出注释为IGFBP、IR、ALS、GSK3和FoxO等基因的相关序列；然后对目的序列的基因结构、系统发育进行分析，依据序列的保守结构域和同其他物种相关序列在发育树上的位置来鉴定各基因；通过多序列比对确定保守氨基酸位点和motif，从而进一步分析各目的基因的功能；根据各基因在不同发育阶段、不同蜕皮时期、不同组织中的表达模式，筛选出潜在关键功能基因进行后续的dsRNA活体干扰实验。 经过筛选，在凡纳滨对虾基因组中得到3条IGFBP、9条IR、13条ALS、1条GSK3和1条FoxO完整序列。通过序列结构分析发现，LvIGFBP包含3个结构域：IB（insulin growth factor binding）结构域、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂（Kazal）结构域和免疫球蛋白C2（IGc2）结构域；LvIR属于酪氨酸激酶受体家族，具有L1-Cys-L2酪氨酸激酶结构域、3个纤连蛋白Ⅲ区域（FN3），以及一个胞内酪氨酸激酶催化（TyrKc）结构域；LvALS含有10-20个LRR结构域；LvGSK3属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员，含有高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化(S_TKc)结构域；LvFoxO在N端具有高度保守的Forkhead DNA-binding （FH）结构域，在C端含有高度保守的Transactivation结构域（TAD）。 基因表达模式分析发现，LvIGFBP1在大多数组织和不同早期发育阶段中表现出较高的表达水平，而LvIGFBP2和LvIGFBP3仅在血细胞中略有表达；LvIR2在仔虾P1期的表达量达到最高，并且在除性腺（卵巢和精巢）之外的所有组织中表达量都较高；LvALS8从胚胎期就开始高表达一直持续到P1期后，并且在成体阶段的肝胰腺、肌肉、血细胞、卵巢中表达量较高；LvGSK3在不同早期发育阶段、大多数成体组织和蜕皮前（D3）阶段均高表达；LvFoxO在不同组织中均有表达，且在肌肉中表达量最高。 IIS通路相关基因的双链RNA活体干扰实验 为了研究IIS通路相关基因在对虾生长中的作用，我们以成体养殖阶段的对虾为实验材料，选取在肌肉和P1期表达量高的基因（LvIGFBP1、LvIR2、LvALS8、LvGSK3和LvFoxO）进行后续的活体双链RNA干扰实验。对干扰后的实验样品进行体重和体长进行测量，以及用实时荧光定量PCR检测干扰效率。数据分析显示，dsLvIGFBP1干扰实验中实验组的体重增加量为对照组的60%左右，明显低于对照组；dsLvIR2干扰实验中实验组的体重增加量为对照组的76%，略低于对照组；dsLvALS8干扰实验中实验组的体重增加量是对照组的119%，略高于对照组；对LvGSK3进行RNA干扰不仅导致体重增加量显著低于对照组（P < 0.05），而且影响蜕皮相关基因的表达；而dsLvFoxO干扰则导致实验对虾死亡率升高，两次干扰的死亡率分别达到75%和50%，均显著高于对照组。 上述实验结果表明，LvIGFBP、LvGSK3 以及LvIR 对凡纳滨对虾的生长有一定的正向调控作用；LvALS 则可能对其生长具有一定负向调控作用；而LvFoxO对凡纳滨对虾的存活具有重要影响。 本论文阐明了凡纳滨对虾IIS通路中的5个相关基因（IGFBP、IR、ALS、GSK3、FoxO）的结构以及它们对对虾生长的影响，为今后甲壳动物相关基因的研究提供了数据基础，也为分子育种提供了一定的理论依据。 |
| 学科主题 | 分子生物学 |
| 语种 | 中文 |
| 目次 | 目 录 摘 要 Abstract 目 录 第一章 绪 论 1.1 胰岛素超家族及相关基因 1.1.1 胰岛素超家族 1.1.2 无脊椎动物的胰岛素超家族基因 1.1.3 胰岛素受体家族 1.1.4 胰岛素生长因子结合蛋超家族 1.1.5 IGFBP酸不稳定亚基 1.2 胰岛素信号通路 1.2.1 胰岛素受体底物蛋白 1.2.2 Akt 1.2.3 糖原合成激酶3（GSK3） 1.2.4 FoxO 1.3 对虾胰岛信号通路相关基因研究的目的和意义 第二章 凡纳滨对虾类胰岛素生长因子结合蛋白基因的结构和功能研究 2.1 材料与方法 2.1.1 实验动物 2.1.2 序列鉴定及分析 2.1.3 多序列比对和系统发生树构建 2.1.4 不同发育时期和不同组织中的表达模式 2.1.5 总RNA提取和cDNA合成 2.1.6 基因克隆 2.1.7 实时荧光定量PCR 2.1.8 IGFBP1重组蛋白表达 2.2 结果和分析 2.2.1 IGFBP基因的序列特征 2.2.2 IGFBP系统进化树 2.2.3 多序列比对 2.2.4 LvIGFBPs三维结构预测 2.2.5 LvIGFBP基因表达谱 2.2.6 LvIGFBP1基因RNA干扰 2.2.7 LvIGFBP1重组蛋白表达 2.3 讨论 2.3.1 LvIGFBP基因的结构特征 2.3.2 LvIGFBPs 系统发生 2.3.3 LvIGFBPs的功能 第三章 凡纳滨对虾类胰岛素受体和类胰岛素生长因子结合蛋白酸性不稳定亚基基因的结构和功能研究 3.1 材料与方法 3.1.1 实验动物 3.1.2 序列鉴定及分析 3.1.3 多序列比对和系统发生树构建 3.1.4 不同发育时期和不同组织中的表达模式 3.1.5 总RNA提取和cDNA合成 3.1.6 基因克隆 3.1.7 实时荧光定量PCR 3.1.8 统计分析 3.2 结果和分析 3.2.1 IR和ALS基因序列特征 3.2.2 IR和ALS系统发育进化树 3.2.3 IR和ALS多序列比对 3.2.4 IR和ALS基因表达谱 3.2.5 IR和ALS基因的RNA干扰 3.3 讨论 第四章 凡纳滨对虾糖原合成酶激酶3基因的结构和功能研究 4.1 材料与方法 4.1.1 实验动物 4.1.2 序列鉴定及分析 4.1.3 多序列比对和系统发生树构建 4.1.4 不同发育时期和不同组织中的表达模式 4.1.5 转录因子预测 4.1.6 总RNA提取和cDNA合成 4.1.7 基因克隆 4.1.8 实时荧光定量PCR 4.1.9 统计分析 4.2 结果和分析 4.2.1 GSK3基因序列特征 4.2.2 GSK3s序列系统进化发育树 4.2.3 多序列比对 4.2.4 LvGSK3三维结构预测 4.2.5 LvGSK3基因表达谱 4.2.6 LvGSK3基因的转录因子预测 4.2.7 LvGSK3基因RNA干扰 4.3 讨论 4.3.1 LvGSK3基因的结构特征 4.3.2 LvGSK3的系统发生 4.3.3 LvGSK3的功能 第五章 凡纳滨对虾FoxO基因的结构和功能 5.1 材料与方法 5.1.1 实验动物 5.1.2 序列鉴定及分析 5.1.3 多序列比对与系统发育树构建 5.1.4 不同发育时期和不同组织中的表达模式 5.1.5 总RNA提取和cDNA合成 5.1.6 基因克隆 5.1.7 实时荧光定量PCR 5.1.8 统计分析 5.2 结果和分析 5.2.1 FoxO基因结构特征 5.2.2 FoxOs系统进化发育树 5.2.3 FoxOs多序列比对分析 5.2.4 LvFoxO基因表达谱分析 5.2.5 LvFoxO基因RNA干扰 5.3 讨论 结 论 参考文献 附录 I 引物序列 致 谢 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
| 页码 | 127 |
| 源URL | [http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/170665]  |
| 专题 | 海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 逄颖. 凡纳滨对虾胰岛素信号通路相关基因鉴定及其对生长影响的初步研究[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2021. |
入库方式： OAI收割
来源：海洋研究所
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