本发明提供一种基于同步光源的X‑射线遗传标记探针的制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)构建同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述融合表达质粒转染进入细胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入底物分子反应液，冰浴反应；4)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及5)同步X射线成像观察；其中，所述酶具有针对所述底物分子的催化活性。本发明还提供一种根据上述制备方法制得的基于同步光源的X‑射线遗传标记探针以及该探针在细胞成像中的应用。根据本发明，提供了一种能对细胞内生物分子进行高特异性识别和高分辨成像的方法，具有良好的生物医学应用前景。