本发明提供一种基于DNA折纸探针特异性标记的单分子基因分型方法及其应用。所述方法包括以下步骤：1)制备DNA折纸探针；2)通过所述DNA折纸探针在目标DNA上进行特异性标记；以及3)在原子力显微镜下对所述标记过的目标DNA进行成像观察。此外，该单分子基因分型方法还可被应用于病人样本的单倍型分型以及未知单倍型信息的实际样品的单倍型分型。总之，根据本发明提供的方法可以有效地检测单核苷酸多态性，并在原子力显微镜下高分辨地观察到单个碱基的位置，从而成功地避免了荧光分子标记在电镜下受限于光学衍射极限限制的问题，可广泛应用于染色体基因变异的原位检测、临床基因诊断等研究领域。