新疆野苹果再生体系、遗传转化体系的建立及CRISPR/Cas9 编辑系统的初探
文献类型：学位论文
| 作者 | 张燕 |
| 答辩日期 | 2019-06-30 |
| 文献子类 | 硕士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 张道远 |
| 关键词 | 新疆野苹果 再生体系 遗传转化体系 CRISPR/Cas9基因编辑 Xinjiang wild apple Regeneration Transformation CRISPR/Cas9 |
| 学位专业 | 工程硕士 |
| 其他题名 | Establishment of in vitro regeneration, genetic transformation and CRISPR/Cas9 gene editing systems in Malus Sieversii |
| 英文摘要 | 新疆野苹果(Malus sieversii)又名塞威士苹果， 隶属蔷薇科苹果属， 是世界栽培苹果的祖先种。新疆野苹果是第三纪孑遗物种，因其自交不亲和特性和自然选择的作用，遗传资源丰富。 以新疆野苹果为主要建群种的天山野果林是我国重要的自然林，在调节气候、涵养水源、保持水土等方面有着重要的生态作用。 近些年来由于农田开发、过度放牧、人为砍伐、苹小吉丁虫危害以及腐烂病爆发等原因，使得新疆野苹果群落面积急剧减少， 本物种已被列为国家濒危二级保护植物，有效保护这一宝贵种质迫在眉睫。为保存优质种质及其基因资源开发利用， 本研究以新疆野苹果为材料，探究了其再生体系、遗传转化体系及 CRISPR/Cas9 基因编辑系统在本物种中的应用。 结果如下：1. 建立了完整的基于愈伤组织分化的新疆野苹果再生体系。以新疆野苹果幼嫩叶片和非茎尖茎段为外植体，经过愈伤组织诱导及不定芽的再生、芽增殖、生根、壮苗和移栽过程，首次建立了完整的基于愈伤组织分化的新疆野苹果的再生体系，最短成苗时间为 2.5 个月。其中， 新疆野苹果叶片最佳诱导再生培养基为 MS+4mg/LTDZ+1mg/L NAA，茎段最佳诱导再生培养基为 MS+1mg/L 6-BA， 叶片和茎段不定芽最高再生率分别为 35%、 90%。 继代培养基为 MS+0.4mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，最佳生根培养基为 1/2MS+0.1mg/L NAA+15g/L sucrose。2. 建立了根癌农杆菌介导的新疆野苹果叶盘转化法。确定了 Kan 和 Hyg 两种抗生素的筛选压分别为 15mg/L， 4mg/L。确定了一种抑菌剂 Cef 的工作浓度（400mg/L）；对比了不同的浸染液、浸染时间以及叶片和农杆菌共同培养方式，确定了农杆菌浸染液为： MS+3% sucrose+150μM AS，共培养及延迟筛选时间分别为 2d为较好的培养方式。通过这种方法， 已获得了大量转基因的愈伤组织。筛选压的存在，会强烈抑制愈伤组织和不定芽的再生，所以又进一步探究了前期不添加筛选压进行稳定转化的可行性： 叶片外植体受到农杆菌浸染后培养基中不添加筛选压，待不定芽长出后再对不定芽进行筛选，已获得了阳性幼芽。3. 建立了新疆野苹果的 CRISPR/Cas9 基因编辑体系。本实验以 MsPDS 为靶标基因，此基因功能缺失会造成植物白化表型，设计了 5 个靶向不同位点的 sgRNA，共构建了 pYL/Cas9， pPTG/Cas9 两类共 8 种不同的载体，转化了叶片外植体，获得了一些阳性的愈伤组织和不定芽。获得了一些白化表型的愈伤组织，并通过测序检测到此基因被编辑的位点附近出现了不同程度的碱基的缺失，证明 CRISPR/Cas9 基因编辑系统可以在新疆野苹果物种中工作。 |
| 学科主题 | 生物工程 |
| 语种 | 中文 |
| 源URL | [http://ir.xjlas.org/handle/365004/15279]  |
| 专题 | 中国科学院新疆生态与地理研究所 新疆生态与地理研究所_研究系统 |
| 作者单位 | 中国科学院新疆生态与地理研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 张燕. 新疆野苹果再生体系、遗传转化体系的建立及CRISPR/Cas9 编辑系统的初探[D]. 北京. 中国科学院大学. 2019. |
入库方式： OAI收割
来源：新疆生态与地理研究所
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