基于阳离子-π作用的铜复合物的抗菌性能与机理研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 王亚迪 |
| 答辩日期 | 2020 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所) |
| 导师 | 吕军鸿 |
| 关键词 | 铜离子 抑菌作用 阳离子-π相互作用 石墨烯量子点 芳香族氨基酸 |
| 英文摘要 | 微生物耐药性严重威胁了人类的健康和生命安全，因此亟需开发新型抗生素或抗菌药物。铜具有广谱抗菌作用且不易产生耐药性，作为人体必需微量元素之一，其应用相对比较安全，且其成本较低。在抗菌的铜材料中，铜离子（尤其是一价铜离子）表现出了较强抗菌性，基于铜的纳米颗粒（包括铜/氧化铜/氧化亚铜纳米颗粒等）具有较高的表面能因此抗菌性也较强，此外，铜金属表面也表现出了优越的杀菌作用。研究表明，铜的接触界面以及其向溶液中释放的铜离子可能在铜表面的抗菌作用过程中发挥着必不可少的作用，此外铜表面还可以通过诱导微生物表面电子转移以及产生活性氧等方式发挥抗菌作用，但目前对具体机制的阐述尚不十分明确。深入探究接触界面以及铜离子在抗菌过程中的作用机理，对于发展更有效的铜抑菌材料十分必要。本论文以含有芳香环结构（以碳原子为主体的六元环状结构，类似于苯环）的石墨烯类纳米材料和芳香族氨基酸为界面，分别通过与二价铜离子Cu(II)的阳离子-π相互作用制备了铜离子-石墨烯量子点复合物和铜离子-色氨酸复合物。首先对复合物进行了表征：利用透射电镜对复合物的粒径和高分辨晶格结构进行了表征、利用等温滴定量热仪测定了铜离子与π体系结合反应的配比及热力学信息、利用X射线能谱表征了复合物的元素组成及铜元素化合价、利用傅里叶变换红外光谱表征了复合物的化学键组成、利用离子回旋共振质谱表征了复合物的分子结构、利用电子自旋共振顺磁波谱表征了复合物中铜元素的自旋电子性质、利用荧光光谱表征了铜离子对π体系荧光的淬灭、利用紫外光谱表征了铜离子引起π体系紫外吸收峰的偏移。然后测试了复合物的抗菌性能：测定了复合物对大肠杆菌的抑菌浓度及抑菌时间曲线、测试了复合物对大肠杆菌生长曲线的影响并测试了其对于多种微生物的抑菌谱。最后探讨了复合物的抗菌作用机理：利用激光共聚焦显微镜表征了复合物在细菌细胞上的结合位置、利用高分辨透射电镜表征了复合物在细菌膜表面的空间取向、测定了复合物对细菌zeta电势的影响、利用膜电位试剂盒表征了复合物对细菌膜电势的影响、利用傅里叶变换红外光谱测定了复合物引起细菌生化组分的变化、利用透射电镜和扫描电镜表征了复合物引起细菌的形貌变化。主要内容包括：1）制备了石墨烯量子点（GQD）-铜离子复合物，对其进行了表征、测试了其抑菌性并探究了抑菌作用机理。通过透射电镜表征发现该复合物粒径介于1-9 nm之间，为单个GQD或多个GQD积聚形成的纳米颗粒；X射线能谱表明铜离子在GQD表面的价态为+1价，表明Cu(II)与GQD带负电的π电子云之间可能发生了电荷转移进而被还原为Cu(I)；红外光谱表征发现Cu(II)引起GQD的C=C，C=O和C-H键吸收峰位置发生较大偏移，表明Cu(II)与GQD的芳环之间发生了较强相互作用；荧光光谱表征发现Cu(II)能够引起GQD荧光的淬灭，即GQD的π键性质发生了变化，以上结果证明了Cu(II)与GQD之间发生了阳离子-π相互作用。通过测试生成的GQD-铜离子复合物的抑菌性能发现，其在8小时内对于大肠杆菌的抑菌效力比相同浓度的Cu(II)强100倍，且对于另外2种革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆）、3种革兰氏阴性菌（绿脓杆菌、阴沟肠杆菌和洋葱伯克霍尔德菌）和1种真菌（白色念珠菌）也具有较强的抑制作用。通过共聚焦显微镜研究发现，GQD本身不容易与细菌结合，而携带正电荷的GQD-铜离子复合物却能够快速地结合在带负电大肠杆菌表面，并逐渐穿越细胞膜屏障内化进入细胞内部。利用形成复合物的Cu(II)和GQD先后分别作用于大肠杆菌，GQD虽能与细菌膜发生结合，但却不能内化进入细胞内部，或许可以解释为，先将Cu(II)添加到细菌中时，Cu(II)会均匀地吸附在细菌细胞膜上，细胞膜上的Cu(II)进而吸附溶液中的GQD到膜上；而复合物添加到细菌中后，纳米颗粒相对均匀地吸附在细菌细胞膜上，但纳米颗粒上负载的Cu(I)使得颗粒所在部位的铜离子局域浓度高于溶液中的铜离子浓度，进而局域地破坏了细胞膜屏障，从而进一步内化进入细胞内部；此外，GQD-铜离子复合物上负载的铜离子为一价，在很多研究中证明一价铜离子比二价铜离子具有更强的抑菌性，这也可能是其能穿越细胞膜屏障的原因之一。通过测定细菌的Zeta电势发现，GQD-铜离子复合物能够显著降低细菌膜表面的负电势，表明带正电的复合物与带负电的细胞膜之间发生了电荷转移；此外，膜电位试剂盒测试发现GQD-铜离子复合物引起细菌细胞膜的去极化，证明细菌细胞膜结构遭到了破坏。高分辨透射电镜揭示了GQD-铜离子复合物是通过其石墨烯片层与大肠杆菌细胞膜表面相垂直的方向插入细胞膜的，其纳米片层可能是通过这个空间取向进一步将细胞膜中的磷脂分子抽提出来进而产生破坏细胞膜的作用。另外通过傅里叶变换红外光谱表征细菌的生化组分发现，GQD-铜离子复合物结合到细菌细胞膜上之后改变了细胞膜的磷脂成分；通过扫描电镜和透射电镜对大肠杆菌的形貌表征后发现，GQD-铜离子复合物处理后细菌的细胞质皱缩、细胞膜发生塌陷，最终导致细菌死亡。2）以含有π体系的一种生物分子芳香族氨基酸-色氨酸为界面，制备了铜离子-色氨酸复合物，对其进行了表征并测试了抑菌性。通过等温滴定量热仪表征发现，当色氨酸过量的时候，其与Cu(II)倾向以2:1比例结合；而当Cu(II)过量的时候，其与色氨酸则倾向于形成1:1的复合物。通过X射线能谱及电子自旋共振波谱分别对这两种复合物进行表征，发现Cu(II)与色氨酸形成的1:2复合物中铜元素价态为+2价，化合价没有发生变化；反之，Cu(II)与色氨酸形成的1:1复合物中铜元素化合价降低为+1价，Cu(II)可能在色氨酸吲哚环带负电的电子云表面被还原，表明此复合物为Cu(II)与色氨酸之间通过阳离子-π相互作用形成。通过红外光谱表征发现，色氨酸与Cu(II)通过阳离子-π相互作用生成铜离子-色氨酸复合物后，其吲哚基团吸收峰强度大大减弱；紫外光谱表明色氨酸与Cu(II)结合后，其π键吸收峰位置发生了一定偏移；荧光光谱表征发现，Cu(II)能淬灭色氨酸的荧光，这些光谱学方法表明Cu(II)大大改变了色氨酸吲哚环的光谱学性质，表明二者之间发生了阳离子-π相互作用。通过测试铜离子-色氨酸复合物对大肠杆菌的抑菌性发现，其具有比相同浓度的Cu(II)离子更强的抑菌性，即Cu(II)与色氨酸通过阳离子-π相互作用反应生成铜离子-色氨酸复合物后会大大增强铜离子的抑菌作用效果。 综上，在本论文中以GQD和色氨酸的芳香环为界面，分别与Cu(II)通过阳离子-π相互作用生成了GQD-铜离子复合物和铜离子-色氨酸复合物，并且两种复合物均表现出了比相同浓度Cu(II)离子更强的抑菌作用。但在我们目前的研究中让色氨酸与Cu(II)在一定的浓度比例下进行反应，使二者更倾向于生成铜离子-色氨酸复合物，但尚未做过进一步纯化，完善对该复合物的纯化方法能够使其优越的抑菌效力进一步展现出来。另外铜离子-色氨酸复合物对于其它病原微生物是否具有广谱抑菌性尚待进一步检测。生物体系是否利用天然的芳香族氨基酸的π体系结合组织周围游离的Cu(II)来帮助机体抵抗外来微生物的入侵、作为自身免疫应答的一部分也还需要大量的实验证据来支持。此外，将Cu(II)还原为Cu(I)进而增强其抑菌能力是否为所有π体系所具有的共性？π体系与其它金属阳离子结合后是否同样具有增强的抗菌效果？解答这些问题将有助于进一步发展新型抗菌材料。 |
| 语种 | 中文 |
| 源URL | [http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/33827]  |
| 专题 | 上海应用物理研究所_中科院上海应用物理研究所2011-2017年 |
| 作者单位 | 中国科学院上海应用物理研究所 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 王亚迪. 基于阳离子-π作用的铜复合物的抗菌性能与机理研究[D]. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所). 2020. |
入库方式： OAI收割
来源：上海应用物理研究所
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