条斑紫菜（Neopyropia yezoensis）不仅是重要的经济海藻，同时还是海藻学研究的模式物种。在其生活史中，单细胞阶段的壳孢子和单孢子分别介导了条斑紫菜孢子体的减数分裂和配子体的无性繁殖，同时也是生产中常用的种苗来源。然而，目前对孢子囊枝放散壳孢子的发育调控机制以及两种孢子发育的分子机制所知甚少，在一定程度上制约了条斑紫菜新型采苗技术的发展。此外，由于条斑紫菜功能基因遗传转化体系尚未完全建立，严重影响了条斑紫菜分子育种和分子机制的探究。针对上述条斑紫菜在种苗、种质和基础研究方面面临的“瓶颈”问题，本论文首先从孢子囊枝出发，深入探究了光照强度和培养密度调控自由孢子囊枝放散壳孢子的基本规律和分子基础。随后，通过单细胞测序深入解析了壳孢子与单孢子基因表达特点，分析了两种孢子在能量代谢、减数分裂以及形态建成等方面的差异。最后，从上述分析结果中挑选重要基因，构建和验证条斑紫菜功能基因遗传转化体系，筛选出多个条斑紫菜功能基因突变株，在此基础上进一步探究了条斑紫菜高光诱导蛋白（high light-inducible protein, NyHLIP）和腺苷酸脱氨酶（Adenosine 5’-monophosphate deaminase, NyAMPD）的功能。主要的研究结果如下：

（1） 自由孢子囊枝形态变化与壳孢子放散的规律：我们发现自由孢子囊枝在高密度下（≥ 5000根/mL）总是呈现出“空心态”。在低密度下（1-1000根/mL），多数孢子囊枝（> 70%）在第3-9天会形成双分细胞，并在第12-15天，双分细胞会消失而没有伴随壳孢子的放散。透射电子显微镜的观察显示，空心细胞中出现严重的胞内降解，并且这种降解可能是通过一种双层膜包裹的小体与液泡融合的方式发生的。在新生的双分细胞中，液泡和胞内降解现象消失，并在双分细胞的伸长过程中重新出现。形态观察结果表明那些消失的没有放散壳孢子的双分细胞以伸长生长的方式返回到了营养生长阶段。壳孢子放散率的统计和鲜重增长的实验表明促进营养生长的因素，如高光（40-100 µmol photons m⁻² s⁻¹）、氨苄青霉素加链霉素（相较于卡那霉素）、生长素吲哚乙酸（Indoleacetic acid, IAA），都会对壳孢子的放散有明显的抑制作用，而低浓度的抗生长素三碘苯甲酸（Triiodobenzoic acid, TIBA，0.1-10 mg/L）则对壳孢子放散有一定的促进作用。这些结果表明壳孢子的放散主要被两种因素所抑制，一个是高密度培养时基于液泡膜转运系统形成的“空心态”抑制了双分细胞的形成从而抑制壳孢子放散，另一个是在适宜生长的条件下，如高光，双分细胞本身返回到营养生长阶段而抑制了放散；

（2） 光照和密度调控自由孢子囊枝发育的分子基础：通过分析比较高光低密度（High light with low denisty, 简称“HL”）、低光高密度（Low light with high denisty, 简称“HD”）两种培养条件与对照组低光低密度（low light with low density, 简称“LD”）之间的转录组学差异，我们发现众多与碳浓缩、碳固定、光合作用、叶绿素合成和氮吸收相关的差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）在HL组中上调，揭示高光促进孢子囊枝营养生长的分子基础。在HD组中，多个植物盐和渗透胁迫、盐离子运输等相关的DEGs上调表达，同时，液泡形成相关的膜转运关键基因—BIG（Brefeldin A inhibited guanine nucleotide exchange protein，布雷菲德菌素A抑制的鸟嘌呤核苷酸交换蛋白），在HD组中表达量最高，HL组中表达量最低。表明高密度下孢子囊枝呈现的空心态可能与液泡形成、盐和渗透胁迫、盐离子转运等有关，BFA处理结果进一步映证了空心态与液泡形成之间的直接关联；另外，在三个实验组中，我们推测在LD组中表达量最高的DEGs可能与壳孢子的放散和形成有关，包括锌指蛋白、ASPO1527、细胞壁组分、细胞周期、细胞骨架等相关的基因；

（3） 壳孢子与单孢子转录组学比较分析：我们分别挑取了微量壳孢子与单孢子（1-30 细胞/样），通过SMART (switch mechanism at the 5′ end of RNA templates，5’端RNA模板转换机制) -Seq2单细胞测序技术对样品进行RNA测序。比较分析结果表明，光捕获和碳固定相关DEGs在单孢子中上调表达，揭示单孢子快速发育和生长的分子基础。在壳孢子中，蛋白质的合成和降解，特别是分子伴侣，相关的DEGs上调表达，表明壳孢子中蛋白质更新活跃。壳孢子中有68个与DNA复制和修复相关的基因进行了表达，表明壳孢子中可能存在DNA的复制活动。此外，通过荧光定量PCR，我们还证实了一个壳孢子特异表达的DEGs（py04595: DNA解旋酶）仅在二倍体阶段（丝状体、孢子囊枝）表达，三个单孢子特异表达的DEGs仅在单倍体阶段（叶状体）表达，表明壳孢子可能更接近于二倍体。这些分子水平的结果表明壳孢子可能是条斑紫菜减数分裂的母细胞，即其萌发阶段的前两次细胞分裂为两次连续的减数分裂。此外，我们还发现与孢子体向配子体形态转化相关的打结状同源盒基因（knotted-like homeobox gene, NyKNOX）仅在孢子体世代（丝状体和孢子囊枝）表达，而在壳孢子、单孢子和叶状体中均不表达，这表明条斑紫菜配子体的形态发生可能需要NyKNOX基因的失活。

（4） 条斑紫菜功能基因遗传转化的探索：我们选择了条斑紫菜高光诱导蛋白（NyHLIP）、腺苷酸脱氨酶（NyAMPD）、核糖磷酸焦磷酸激酶（Ribose phosphate pyrophosphokinase, NyPRPS）和叶绿素合酶（Chlorophyll synthase, NychlG）等基因，构建了用于遗传转化的沉默与过表达质粒。通过基因枪方法和潮霉素筛选压力，成功筛选出了多株阳性突变株，在DNA验证层面，总体阳性率约为49%。RNA层面的验证结果表明约70%的过表达株目标基因发生了显著上调，最高能上调40多倍，大多数上调倍数在10倍以内；约37%的过表达株出现共抑制现象，有一株下调超过100倍，其余下调在10倍以内；约68%的突变株目标基因发生显著下调，但下调倍数均在4倍以内。这些结果表明通过基因枪的方式，可以在条斑紫菜叶状体中实现功能基因的遗传转化，包括功能基因的沉默与过表达，同时还会出现共抑制现象；

（5） 条斑紫菜NyHLIP功能探究：基于qRT-PCR和Western blot结果，我们发现在高光处理6 h后的低光恢复过程中，NyHLIP在RNA水平和蛋白水平能够存在较长时间。RNA恢复到高光处理之前的水平大约需要24 h左右，而蛋白至少可以大量存在24 h。通过蛋白水平的验证，我们从NyHLIP突变株中挑选出了OE32（共抑制型）和Ri32（RNAi型），这两株在高光胁迫后NyHLIP的蛋白含量明显低于WT株。光合活性测量结果显示高光处理6 h后，OE32和Ri32株光系统II的最大光化学量子产量（F_v/F_m）、实际光化学量子产量（YII）、电子传递速率（ETR）等值明显低于WT株，同时光系统I反应中心P700的还原速率也明显低于WT株，但在非光化学淬灭（Nonphotochemical quenching，NPQ）方面没有明显差异。这些结果表明NyHLIP可能在高光胁迫下维持光系统II的基本活性、电子传递以及维持光系统I的还原活性等方面起着重要的作用；

（6） 条斑紫菜NyAMPD功能探究：腺苷酸脱氨酶（AMPD）能够催化磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）分解为鲜味物质肌苷5’-单核苷酸（Inosine 5’- mononucleotide，IMP）。从NyAMPD突变株中，我们分别选择了过表达株（Overexpression，简写为“OE”）AMD2-2、共抑制株（Co-suppression, 简写为“Ci”）AMD1-2、沉默株（RNAi，简写为“Ri”）iAD2-5进行生理水平探究。生长实验表明，相较于WT，OE株生长更快，而Ci与Ri株生长更慢。光合参数测定显示突变株与WT之间无显著差异。腺嘌呤核苷酸相关代谢产物测定显示OE株中鲜味物质IMP含量是WT中的2倍多，ADP、AMP含量显著低于WT，表明OE株中过表达效果良好。但在Ci和Ri株中，IMP含量也升高了，ADP和AMP的含量也降低了。针对条斑紫菜另一个AMPD（即NyAMPD2）基因表达量的检测表明，与WT相比，Ci和Ri株中NyAMPD2显著上调表达，而在OE株中无明显差异。我们认为转基因导致的NyAMPD基因的下调可能会引起NyAMPD2基因的上调，从而使得Ci和Ri突变株中IMP、ADP、AMP的含量出现于OE株类似的变化。

上述结果解析了自由孢子囊枝放散壳孢子的发育调控过程和分子基础，揭示了壳孢子与单孢子基因表达水平差异，同时构建了条斑紫菜配子体功能基因遗传转化体系并验证了其效率，对条斑紫菜的养殖和基础研究具有重要指导和借鉴意义。