重组乙肝表面抗原分离纯化及其分子特性研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 周卫斌 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2006-06-17 |
| 授予单位 | 中国科学院过程工程研究所 |
| 授予地点 | 过程工程研究所 |
| 导师 | 苏志国 |
| 关键词 | 乙肝表面抗原 纯化 多角度激光散射 层析介质 分子特性 |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 作为多聚亚基蛋白，乙肝表面抗原(HBsAg)的纯化工艺均具有活性回收率偏低的缺点，限制了其作为乙肝疫苗推广应用。为提高HBsAg活性回收率，本文对分别由CHO细胞和汉逊酵母细胞表达的HBsAg的分离纯化过程进行了优化，并对其分子特性进行了研究。本文优化了CHO细胞来源rHBsAg(CHO-HBsAg)的纯化工艺；开发了一条简单有效的汉逊酵母细胞来源rHBsAg(Hans-HBsAg)的纯化工艺；此外，为探究HBsAg生物活性与分子结构之间的关系，本文还采用多角度激光-高效分子排阻色谱联用技术对两重组乙肝表面抗原的分子特性进行了探索，如下所述： 1) 优化了CHO-rHBsAg纯化工艺单元操作。通过在疏水层析(HIC)前加入硫酸铵沉淀技术分离、浓缩和澄清细胞培养上清液(可除去75%以上杂蛋白)，同时优化HIC操作条件，使HIC的纯化倍数从原低于40增加到120以上，并使HIC介质的交换容量增加一倍以上，同时延长了HIC介质的使用寿命； 2) 通过在CHO-HBsAg分离纯化单元操作(离子交换层析和凝胶过滤层析)中采用1%纯化伴侣A保护重组HBsAg的结构完整性，使CHO-HBsAg的最终总活性回收率由原来的不到20%增加到40%以上，最终产品纯度达到电泳纯(SDS-PAGE)和色谱纯(HPSEC)，即其纯度在98%以上，达到国家药典标准。 3) 开发了一条针对Hans-rHBsAg的简便、高效的纯化工艺。纯化工艺主要由离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤等三步层析集成，最终产品纯度达99%以上，5000人份中试水平(150mg)的Hans-HBsAg的活性回收率大于21%。三步层析工艺易于放大和调控，与传统工艺采用超离心至少需耗时96小时相比，该工艺在中试规模中每批实验仅需35小时即可完成。 4) 新型层析介质的自主开发与应用。为减少多聚亚基蛋白在纯化中因吸附层析介质多位点吸附造成的亚基解离导致的活性损失以及层析介质长期依赖进口等问题，开发了针对CHO-HBsAg和Hans-HBsAg的具有不同配基密度的疏水层析介质(Butyl QZT-3)，经筛选后应用于二者的纯化工艺中，前者可取得相似纯化效果，可用于替代原工艺中的HIC介质，后者可获得95%和10以上的活性回收率和纯化倍数，高于进口介质的不到80%和4的活性回收率和纯化倍数。 5) 为探究rHBsAg分子特性与生物活性之间的关系，联用多角度激光散射技术(MALLS)与高效分子排阻色谱(HPSEC)技术对两重组HBsAg的分子量、分子尺寸以及其分布等分子特性进行了对比，发现CHO-HBsAg具有更高的平均重均分子量和均方根回旋半径分别为4921 KD和22.1 nm(与血源HBsAg分子尺寸相近)，而Hans-HBsAg的平均重均分子量和均方根回旋半径仅为3010 KD和18.1 nm。此外，CHO-rHBsAg 颗粒平均具有155个亚基蛋白，而Hans-rHBsAg颗粒仅平均具有86个。上述数据为揭示不同来源的HBsAg颗粒存在免疫原性、电荷性与疏水性等方面性质差异提供了分子结构方面的证据。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-13 |
| 页码 | 147 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1011]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 周卫斌. 重组乙肝表面抗原分离纯化及其分子特性研究[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2006. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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