新疆雪莲微繁殖和种质冷冻保存
文献类型：学位论文
| 作者 | 郭斌 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2008-01-29 |
| 授予单位 | 中国科学院过程工程研究所 |
| 授予地点 | 过程工程研究所 |
| 导师 | 刘春朝 |
| 关键词 | 新疆雪莲 低温 植物生长激素 TDZ 超低温保存 微繁殖 |
| 其他题名 | Micropropagation and Germplasm Cryopreservation of Saussurea involucrata Kar. et Kir. |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 新疆雪莲（Saussurea involucrata Kar. et Kir.）属菊科（Compositae）菜蓟族 （Trib. Cynareae Less.）凤毛菊属 （Saussurea sp.）植物，是我国高山地区民间常用的一类名贵中草药。目前，由于滥采滥挖，新疆雪莲野生植物资源已濒临枯竭，而市场的需求不断增加，导致供需矛盾日渐突出。为了解决新疆雪莲资源短缺的问题，本研究以组织培养为手段建立了新疆雪莲快速繁殖体系，并研究了低温预处理和N-苯基-N’-（1，2，3-噻二唑-5-基）脲[N-phenyl-N-（1, 2, 3-thidiazol-5-yl）urea，TDZ]对强化新疆雪莲芽再生过程的策略，并从生理、生化的角度探索其可能的作用机制。在以上研究的基础上，建立了新疆雪莲超低温保存工艺。 实验研究了芽诱导的最适条件，即：MS培养基添加2.5 µM 1-萘乙酸（1-naphthaleneacetic acid，NAA）和10 µM 6-苄氨基嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA），蔗糖浓度30 g/L，外植体为生长40天的种子苗的叶片。芽的诱导频率和每个外植体上的芽数目分别可达到66 %和5.2个。研究了不同浓度3-吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）对生根的影响。结果表明不同浓度IAA均能够在不同程度上诱导根的发生，最合适的IAA浓度是2.5 µM，培养42天后根诱导频率可达到90 %。将生长35天的试管苗移栽到人工基质（南方营养土：蛭石：珍珠岩=3：1：1），一个月后成活率可达85 %。 为了进一步提高芽的诱导效率，采用低温预处理（4 ℃）手段对该过程进行优化，结果表明，将外植体叶片在低温下预处理5天可显著提高芽的诱导频率和每个外植体上出芽的平均数量，分别可以达到81 %和9.3个，比对照提高了24 %和78 %。从植物组织内源激素和氧化还原动态平衡的角度探索低温预处理诱导分化的机制，结果表明：在短期（5天）低温处理下内源玉米素（zeatin，ZT）和IAA的比值显著提高，同时内源的赤霉素（gibberellic acid，GA3）含量增加。短期的低温处理增加了组织内部过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）的积累，而超氧阴离子（super oxide anion，O2∙ −）的含量呈现先增高后降低的变化，组织的还原力降低而处于氧化态。因此，在新疆雪莲芽分化过程中，ZT/IAA比值和GA3水平的增高是促进新疆雪莲芽分化的重要内在因素；组织中氧化态的增强为新疆雪莲芽的分化提供了必要的胞内环境。 研究了人工合成激素TDZ对新疆雪莲分化过程的影响。最适TDZ浓度为0.5 μM、作用时间为28天，每个外植体叶片上的平均芽数目可达到15.6 个。TDZ诱导芽再生过程中内源激素的测定结果表明TDZ处理促进了内源ZT和GA3的积累，在培养的第28天达到最大值；IAA在培养的第21天达到最大值。这说明，TDZ诱导新疆雪莲芽的分化主要是通过提高内源ZT和GA3 水平而实现的。这说明ZT/IAA的值和GA3的含量是新疆雪莲芽诱导的关键性因素。对TDZ诱导新疆雪莲芽发生过程中组织内抗氧化酶变化的研究表明，在TDZ作用下内源的过氧化物酶（peroxidase，POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力显著增加，并伴随着内源H2O2和一氧化氮（nitric oxide，NO）信号的增强，但NO信号的变化延迟于H2O2信号的变化。TDZ处理与短期低温预处理相比，抗氧化酶活性和内源H2O2 含量的变化趋势相同；但是，在TDZ作用下各参数的变化程度更大。 建立了新疆雪莲超低温保存的工艺。首先，探索了新疆雪莲超低温保存的基本流程，其步骤是：将雪莲愈伤组织在添加0.3 M蔗糖的MS培养基上预培养3天，转移到添加60 % PVS2培养液中装载40 min，再转入PVS2培养液中，于0 ℃下脱水60 min，然后迅速更换新的PVS2溶液并转移到液氮中保存。此保存工艺下可获得56 %的细胞存活率和36 %的恢复率。在含有2.5 µM NAA和10 µM 6-BA的培养基上培养6周后出芽频率为66 %，每个外植体上产生3.1芽。为了更进一步提高超低温保存后组织的存活率和芽的再生频率，在超低温保存前将新疆雪莲愈伤组织于4 ℃下进行低温锻炼，以提高组织对低温的耐受性。结果表明，12天低温预处理显著提高了超低温保存后组织的存活率和恢复频率，分别达到75 %和66 %。同时，经过低温锻炼后，超低温保存材料的芽分化能力增强，出芽频率达到100 %；每个外植体上芽的数量达到8.5个，分别是对照的1.4倍和2.4倍。组织切片观察结果表明，低温锻炼使细胞质变的浓厚，细胞核增大。这些生理方面的变化与植物组织对低温耐受能力的提高密切相关。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-13 |
| 页码 | 113 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1034]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 郭斌. 新疆雪莲微繁殖和种质冷冻保存[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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