分枝型聚乙二醇的合成及修饰蛋白质的研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 李兴奇 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-17 |
| 授予单位 | 中国科学院过程工程研究所 |
| 授予地点 | 过程工程研究所 |
| 导师 | 马光辉 |
| 关键词 | 合成:分枝型聚乙二醇:修饰:重组人粒细胞集落刺激因子 |
| 其他题名 | Studies on synthesis and Application of Branched mPEG for Protein Modification |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 随着基因工程技术的发展，蛋白质作为治疗药物在近几年得到了很大的发展。但蛋白质本身的缺陷（抗原性、半衰期短、稳定性差等）使其药效没有得到充分发挥。利用生物相容性高分子，聚乙二醇（PEG）修饰蛋白质可以有效地降低药物蛋白质的免疫原性、延长其循环半衰期并改善其药代动力学/药效，因此成为近年来的研究热点。分枝型聚乙二醇修饰蛋白质相对于线型聚乙二醇具有以下优点：更大的分子量；更好的pH稳定性和热稳定性；更好的抗蛋白水解酶性能；同时抗原和免疫原性大为减少。因此，分枝型聚乙二醇的制备和应用受到广泛的关注。本论文针对现有工艺的不足，发展了一种制备新结构分枝型聚乙二醇的工艺，并使用所合成的分枝型聚乙二醇对重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）进行了修饰研究。 本论文分为四部分，第一部分建立了不同分子量聚乙二醇的分析检测方法，采用反相高效液相色谱检测不同分子量聚乙二醇。由于随着聚乙二醇分子量的增加，聚乙二醇分子和反相基质相互作用面积增大，疏水相互作用增强，因而洗脱所使用的洗脱剂（乙腈）浓度相应增高。通过洗脱剂的浓度确定聚乙二醇的分子量，确定不同分子量聚乙二醇（5000、10000、20000Da）洗脱所需洗脱剂浓度。为以后合成分枝型聚乙二醇奠定了分析检测基础。 第二部分发展了合成羧甲基化聚乙二醇的新方法，以水作为溶剂，以催化剂量的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基（TEMPO）为氧化剂、以溴化钾为催化剂、以次氯酸钠为再生氧化剂，采用一步氧化，即可将聚乙二醇按化学计量转化为聚乙二醇羧酸。该方法的优点是操作简单、条件温和、环境友好、转化率高。 第三部分以羧甲基化聚乙二醇为原料，发展了一种合成新结构分枝型聚乙二醇的新工艺，使用羧甲基化聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯和赖氨酸乙酯以二氯甲烷为溶剂加热回流反应，反应后的产物经皂化和酸化后，使用SPG（Shirasu Porous Glass）膜乳化技术制备的均一、高比面积的聚苯乙烯（PST）介质，低压反相层析纯化分枝型聚乙二醇。新工艺的优点是充分利用了羧甲基化聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯的高反应活性和赖氨酸乙酯上的氨基的高亲核性，聚乙二醇N-羟基琥珀酰亚胺活化酯在二氯甲烷中的稳定性及赖氨酸乙酯的溶解性，与现有工艺相比，提高了反应产率，避免传统工艺在水相中反应，造成活化酯水解的问题；新工艺合成的分枝型聚乙二醇的结构新颖，在聚乙二醇与赖氨酸连接的化学键为酰胺键，代替现有工艺合成的脲烷键，其结构更加稳定。使用PST介质分离纯化分枝型聚乙二醇消除了不可逆吸附现象，而且反压低，有利于低压层析操作，并且分离精度高。 论文第四部分使用合成的分枝型聚乙二醇对rhG-CSF进行了修饰研究，以确认所合成的分枝型聚乙二醇的有效性。对修饰条件进行了优化，纯化了单修饰产物并对其表征。并对分枝型和线型聚乙二醇修饰的单修饰产物体外生物活性和药代动力学参数进行了比较。结果表明分枝型聚乙二醇修饰的单修饰产物与线型聚乙二醇修饰的单修饰产物体外活性相当，分别为未修饰产物的54%和61%，但是两者的体内血液循环半衰期与未修饰rhG-CSF循环半衰期（T1/2=40分钟）比较，分别延长到190和120分钟，分枝型聚乙二醇修饰的单修饰产物的相对生物利用度为2.01，而线型聚乙二醇修饰的单修饰产物的相对生物利用度为1.32。分枝型聚乙二醇修饰的单修饰产物在体内药代动力学明显优于未修饰的rhG-CSF和线型聚乙二醇修饰的单修饰产物。因此，分枝型聚乙二醇修饰rhG-CSF的单修饰产物具有良好的临床应用前景。 本论文发展的分枝型聚乙二醇，无论工艺还是修饰剂本身均有新颖性，在未来的聚乙二醇化技术领域有很好的应用前景。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-13 |
| 页码 | 149 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1036]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李兴奇. 分枝型聚乙二醇的合成及修饰蛋白质的研究[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2007. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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