纯化过程中溶剂环境对蛋白质结构的影响
文献类型：学位论文
| 作者 | 李岩 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2008-02-19 |
| 授予单位 | 中国科学院过程工程研究所 |
| 授予地点 | 过程工程研究所 |
| 导师 | 苏志国 |
| 关键词 | 乙肝病毒表面抗原 纯化 多羟基化合物 聚乙二醇 聚集 解聚 变构 |
| 其他题名 | The effect of solution environment on the protein structure during purification |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 蛋白质在超滤和层析过程中可能会发生变构、聚集或者解聚，对其溶解性、活性以及免疫原性产生很大影响。本论文分别以牛血清白蛋白（BSA）和乙肝病毒表面抗原（HBsAg）为对象，对单体蛋白质和多聚亚基蛋白质在超滤和层析中的行为进行了考察；然后用PEG和多羟基化合物对纯化过程中的溶液环境进行调整，考察它们在超滤和层析过程中对单体蛋白质和多聚亚基蛋白质的保护作用；最后通过对溶液环境的调整改进了中国仓鼠卵巢细胞所表达HBsAg（CHO-HBsAg）的纯化工艺。论文结果摘要如下： 1）单体蛋白质在酸性pH条件下超滤会发生构象变化，糖类和多元醇等多羟基化合物在超滤中对蛋白质的保护作用是由于其对溶液热力学性质的改变。葡萄糖、甘油、蔗糖、甘露醇和山梨醇中以5%的甘露醇效果最佳，实验表明在此条件下超滤前BSA中β-折叠的含量为19%，超滤后为21%。 2）BSA在离子交换层析上可能会发生可逆的变构。糖和多元醇等多羟基化合物使BSA在离子交换层析中的保留时间提前，这可能是由于多羟基化合物屏蔽了蛋白质与介质之间的静电相互作用。 3）与单体蛋白质相比，HBsAg这种多聚亚基蛋白质在超滤过程中会发生聚集和吸附，造成其活性损失。实验表明HBsAg在超滤中形成聚集体的ELISA活性只有正常装配体的1/3。HBsAg聚集以后其二级结构发生了很大的变化，而且HBsAg分子中的脂类成分的结构可能发生了变化。虽然PEG不能对不稳定的单体蛋白质在超滤中提供保护，但是能够有效地降低HBsAg在超滤中的失活。1%的PEG10000可以有效减少HBsAg在超滤过程中的吸附和聚集，将其活性收率由不到10%提高至65%以上。在热力学上，PEG会促进HBsAg的聚集；在动力学上，PEG的体积位阻效应可以有效地减少HBsAg分子之间的碰撞，从而减少其聚集。 4）与单体蛋白质相比，HBsAg这种多聚亚基蛋白质在离子交换层析中非常不稳定，会发生聚集、解聚以及变构。介质与蛋白质之间的静电吸附是HBsAg变构的驱动力。变构反应可分为两步，快速变构步骤和慢速变构步骤。快速变构步骤中HBsAg的变构是不可逆的，而慢速变构步骤中HBsAg的变构是可逆的。虽然多羟基化合物可能会减弱单体蛋白质和离子交换介质之间的静电相互作用，但都不能抑制HBsAg的解聚。不过某些亲水性化合物可以有效减少HBsAg在已使用多次的介质上的活性损失，可将HBsAg的活性收率由20.4%提高到72.9%。 5）在纯化过程中加入亲水性化合物，HBsAg在离子交换层析中的收率由60%提高到80%，超滤浓缩过程的收率由48.6%提高到89.7%，凝胶过滤层析中的收率由56.1%提高到了91.2%。在实验室小试的结果表明这种方法可以得到高纯度的HBsAg纯品，而且总的活性收率达到40%以上，比原工艺的收率提高了一倍以上。将此工艺成功进行了1000人份的放大，制备出的纯品符合国家药典要求，收率约为40%。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-13 |
| 页码 | 170 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1037]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李岩. 纯化过程中溶剂环境对蛋白质结构的影响[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2008. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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