蛋白质化学修饰的过程探索
文献类型：学位论文
| 作者 | 郑春杨 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2007-06-01 |
| 授予单位 | 中国科学院过程工程研究所 |
| 授予地点 | 过程工程研究所 |
| 导师 | 苏志国 |
| 关键词 | 蛋白质化学修饰 聚乙二醇(PEG) 人血清白蛋白(HSA) 长效基因工程药物 血液代用品 |
| 其他题名 | Bioconjugation of Proteins via Process |
| 学位专业 | 化学生物学★ |
| 中文摘要 | 蛋白质化学修饰技术是现代生物技术发展的一个重要方向，以聚乙二醇(PEG)为修饰剂和以蛋白质为修饰剂是该技术的两个主要类型。 PEG修饰技术发展成熟，已经有几种PEG-蛋白质药物经过FDA认证。为了有效地检测和分离修饰产物，本论文首先用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、高效凝胶过滤、高效反相层析方法检测PEG修饰蛋白的组成。随着PEG分子量的减少和被修饰蛋白分子量的增大，这三种常用方法的分辨率都相应降低。重点考察了PEG修饰蛋白的SDS-PAGE电泳过程，发现不带电的PEG分子在SDS胶束的作用下参与了电场运动，从而导致分辨率下降。改用没有SDS的非变性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(native-PAGE)后分辨率显著提高，未与白蛋白连接的PEG不参与电场运动，未修饰HSA和不同修饰程度的PEG-HSA偶联物得到有效的检测和分离。 进行了膜分离PEG修饰和未修饰蛋白质(和多肽)的考察。被修饰物质的分子量和结构对分离效果有影响，低分子量的小肽可以通过膜分离与PEG-小肽偶联物完全分开。传统的PEG反应方法中，产物是未修饰小肽(5%)、单修饰产物(42%)、二修饰和多修饰产物(53%)的混合物，而将膜分离与PEG修饰反应耦合，及时将PEG修饰产物移除,小肽100%转化成为单修饰的目标偶联物。说明反应和分离耦合是提高PEG修饰反应产量和降低成本的有效途径。 从理论上讲，与PEG修饰相比，蛋白质类修饰剂具有代谢途径明确、可以提供靶向性和其他的生物活性的优点。但是，蛋白质-蛋白质偶联反应的产物不均一、产物评价困难限制了其发展。本文以戊二醛为交联剂采用人血清白蛋白(HSA)修饰血红蛋白，对修饰过程进行了探索。 考察了人血清白蛋白和血红蛋白的戊二醛一步交联反应，发现pH是影响反应的关键因素。在蛋白质的等电点附近发生蛋白质自身的聚合反应，而在两种蛋白质的等电点的平均值附近，两种蛋白质的偶联反应被促进。并且，参与反应的蛋白质的结构和相互作用对产物组成有很大影响。据此，建立了四种方法制备人血清白蛋白和血红蛋白的偶联物。分别是：⑴分步法偶联血红蛋白和人血清白蛋白：基于血红蛋白的结构特点，先用戊二醛分子内交联血红蛋白，转化率95%，效果接近于使用专一的血红蛋白分子内交联试剂DBBF；然后，分子内交联血红蛋白与人血清白蛋白偶联，血红蛋白和人血清白蛋白1:1目标偶联物产率34.5%，副反应产物占4%。反应时间为11个小时。⑵拥挤效应辅助偶联血红蛋白和人血清白蛋白：采用聚乙二醇作为拥挤试剂，空间上分布和间隔参与反应的蛋白，提高蛋白的局部浓度。血红蛋白和人血清白蛋白1:1目标偶联物产率35%，副反应产物占4%。反应时间2个小时。⑶凝胶过滤层析柱上偶联血红蛋白和人血清白蛋白：采用凝胶过滤柱动态分离形成的目标偶联物，反应时间和产物组成均与层析速度有关。⑷甘露醇-硼酸-硼砂缓冲液络合体系偶联血红蛋白和人血清白蛋白：络合体系起到切换反应pH和促进反应的作用，血红蛋白和人血清白蛋白的偶联物产率45%，血红蛋白和人血清白蛋白各自的聚合副反应被抑制。反应时间为5个小时。与已有的价格昂贵的异型双功能交联剂偶联和耗时的二步偶联方法相比，以上四种策略都可以达到低成本、高效率制备人血清白蛋白和血红蛋白偶联物的目的，为这种人血清白蛋白-血红蛋白新型血液代用品的发展打下基础。 另外，还研究了使用乙二醇二缩水甘油醚(EGDE)偶联人血清白蛋白和胰岛素。由于分子链长，EGDE在活化人血清白蛋白的时候没有二聚体和多聚体形成。利用该性质简化了人血清白蛋白的活化工艺，制备了均一的人血清白蛋白-胰岛素偶联物，在稳定性等方面明显优于天然胰岛素。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-13 |
| 页码 | 146 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1092]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 郑春杨. 蛋白质化学修饰的过程探索[D]. 过程工程研究所. 中国科学院过程工程研究所. 2007. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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