疏水层析介质的配基设计和蛋白质吸附洗脱特性
文献类型：学位论文
| 作者 | 孟庆强 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2010-06-11 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 马光辉 |
| 关键词 | 疏水相互作用层析 多相互作用层析 分离介质 吸附 溴化氰活化胶 |
| 其他题名 | Ligand Design of Hydrophobic Interaction Chromatography Media and Their Protein Adsorption/Elution Behavior |
| 学位专业 | 生物化工 |
| 中文摘要 | 生物分离介质是生物技术发展的重要硬件。不断诞生的蛋白质产品需要性能各异的介质，而现有商品化介质较单一的配基密度和连接结构已不能完全满足发展要求。同时，在介质的分离应用过程中，介质与蛋白质之间的微观相互作用还没有得到很好的理解，也限制了介质应用水平的进一步提高。本论文系统研究了疏水层析介质的制备过程，制备出配基密度和连接结构不同的几种疏水层析介质，对其蛋白质吸附洗脱特性进行了考察。首先制备了通过O原子连接介质骨架与配基的疏水层析介质，采用丁基、辛基或苯基缩水甘油醚与琼脂糖凝胶的羟基直接反应，制备出疏水层析介质。在制备过程中发现反应体系内的含水量影响反应的重复性，含水量低于200ppm时，实验重复性好。优化了反应条件，通过调节烷基或苯基缩水甘油醚的用量控制产品配基密度。考察了介质的性能指标，结果表明：制备的介质在机械稳定性、化学稳定性、蛋白质回收率、配基分布均匀性以及对蛋白质混合物的分离效果等均达到了国际上主要厂家同类介质的水平。在上述研究基础上，探索N原子连接介质骨架与配基的疏水层析介质。第一类介质是对琼脂糖羟基进行环氧基活化，然后与丁胺和辛胺反应，制备出以N原子连接的疏水层析介质。由于N原子在特定pH值下带正电荷，因此此类介质是多相互作用层析介质。环氧基活化胶的制备方法为：用烯丙基缩水甘油醚活化法制备烯丙基琼脂糖凝胶，然后再将烯丙基溴化，最后环氧化。确定了偶联反应的最佳反应条件，通过调节胺的用量可控制配基密度。激光共聚焦结果表明，在以上条件下制备的介质配基分布均匀。第二类N原子连接的疏水层析介质是对琼脂糖羟基进行溴化氰活化，再与丁胺和辛胺反应制备出的介质。该方法产生的N原子分带电和不带电两种，也具有多相互作用性质。重点考察了pH值和温度对介质配基密度、配基分布和电荷基团含量的影响。结果表明：配基密度和电荷基团密度在弱碱性下最高，电荷基团密度占总配基密度的比例在强碱性下最低；在利于活化胶活性基团稳定的条件下（-4℃，pH8.3）偶联配基，配基密度均一，高温（25℃）或高pH值(pH10.0）等不利于活性基团稳定的条件均会导致配基分布不均一。由于溴化氰活化胶的应用非常广泛，本论文重点研究了它的冻干保存工艺，考察了pH值对活性基团稳定性的影响、添加剂聚乙二醇（PEG）和乳糖对溴化氰活化胶球形结构及表面形态的影响。发现：同时使用PEG和乳糖做冻干添加剂对活化胶球形形态的保护效果优于单独使用其中的一种添加剂。经优化，冻干条件为：使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH4.0）维持pH值，添加10% PEG8000和10%乳糖，-20℃冰箱冷冻，-20℃下真空冷冻干燥24h，然后在25℃下真空干燥2h。用制备的冻干活化胶制备亲和层析介质，分离性能和同类商品化介质接近。以O原子连接的疏水层析介质为代表考察了蛋白质的疏水吸附行为，发现：当体系的盐浓度或温度升高到某一特定值时，疏水吸附等温线的类型会由Freundlich型转变为Langmuir型。分析认为原因可能是：在低盐浓度下被吸附的蛋白质分子之间存在排斥力，使吸附等温线表现为Freundlich型；而在高盐浓度下蛋白质分子之间的作用力与蛋白质与介质之间的疏水作用相比可以忽略，这使吸附等温线表现为Langmuir型。在高盐浓度下吸附蛋白质、用不含盐的缓冲液洗脱时，在柱内发生的吸附等温线类型的转换会引起峰裂解。比较了上述三类疏水层析介质的吸附和分离性能，考察电荷作用对蛋白质吸附分离的影响。根据蛋白质的吸附行为差异，确定了多相互作用层析新的洗脱路线，即先降低盐浓度，再改变pH值，利用带电疏水层析介质成功分离了蛋白质混合物（核糖核酸酶A、溶菌酶和牛血清白蛋白），而用纯疏水层析介质无法将此混合物完全分离。和纯疏水层析介质相比，带电疏水层析介质在分离过程中同时利用蛋白质的疏水性差异和带电性差异，带电疏水层析介质把疏水层析和离子交换层析合二为一，在实际生产应用中可以减少由疏水层析到离子交换层析的处理环节，简化操作过程。 |
| 英文摘要 | Chromatographic media play an important role in the development of biotechnology research and industry. With the emergence of new protein products, commercially available media are not satisfactory for the requirements of the separations due to fixed ligand density and structure. Additionally, the interaction between chromatographic media and protein molecules has not been entirely understood, which limited the further usage of media in the practical application. In this thesis, preparation of Hydrophobic interaction chromatography (HIC) media with different ligand density and spacer structure were systematically studied to find the key points, and the adsorption and elution performance of the prepared media were deeply investigated and compared. |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-17 |
| 页码 | 165 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1494]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 孟庆强. 疏水层析介质的配基设计和蛋白质吸附洗脱特性[D]. 中国科学院研究生院. 2010. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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