基于荧光点亮RNA适配体的RNA活细胞成像研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 刘文晗 |
| 答辩日期 | 2021 |
| 文献子类 | 博士 |
| 授予单位 | 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所) |
| 导师 | 宋世平 |
| 关键词 | 活细胞成像 RNA成像 荧光点亮RNA适配体 环状RNA 翻译 |
| 英文摘要 | RNA是重要的生命遗传物质,DNA携带的遗传信息通过m RNA翻译为承担各种生命活动功能的蛋白质。此外,一些非编码RNA也在基因的表达调控中扮演了重要的角色。RNA的突变或者表达水平的异常往往会导致疾病,如先天免疫疾病,神经退行性疾病,血管疾病和癌症等。了解RNA在亚细胞水平的分布、转运、和分子间相互作用对于研究RNA是如何参与基因的表达调控有重大意义。这些信息可以由RNA活细胞成像技术直接获得。荧光标记RNA的方法有很多,其中,荧光点亮RNA适配体以其小体积、低背景、高生物相容性的优点在RNA活细胞成像中具有巨大的潜力。本课题应用荧光点亮RNA适配体构建了合适的荧光成像体系对环状RNA和m RNA的丰度及亚细胞分布进行了实时观测,并考察了m RNA的转录翻译过程。主要研究内容和成果总结如下:1、构建基于荧光点亮RNA适配体的荧光探针用于环状RNA的活细胞成像环状RNA是一种新型的非编码RNA,在生理和病理过程中都起着至关重要的作用。尽管通过生物信息学鉴定了成千上万的环状RNA,但它们的细胞过程和调控机制仍待开发。环状RNA的成像可以提供有关其丰度,分布和运输的直接信息,这有助于了解其功能和调控。当前使环状RNA可视化的方法主要限于固定样品,针对环状RNA的活细胞成像手段亟待发展。低丰度和前体线性RNA的存在使得环状RNA可视化面临巨大挑战。在这部分的工作中,我们构建了可遗传编码的基于分离荧光点亮RNA适配体的荧光探针(SAFP),并将其用于CDR1as的活细胞成像,CDR1as是在基因调控中起重要作用的环状RNA。SAFP可以成功地以高选择性对CDR1进行实时成像。通过对多种细胞系中CDR1as的表达水平进行成像分析和比较,结果证明CDR1as主要在神经元和胚胎组织中表达。此外,SAFP实现了对于P19细胞神经元分化这样长时间过程(9天)中CDR1as的表达水平的实时监测。以上结果表明,SAFP探针有望发展为一种普适的circ RNA成像探针。2、利用荧光点亮RNA适配体长时程追踪m RNA转录与翻译细胞内的转录和翻译过程均受到严格的时空调控,以确保蛋白质在正确的发育阶段和组织细胞中合成。因此,建立在活细胞水平对转录和翻译进行实时成像的方法对于理解基因转录、m RNA转运、翻译调控的动态过程至关重要。常用的m RNA荧光标记体系MS2-GFP体系存在背景高、细胞表达负担大、会干扰目标m RNA的正常转运和生理功能等局限性,需要建立新的m RNA荧光标记手段。在本部分的工作中,我们开发了一种基于荧光点亮RNA适配体的RNA标记模块,并利用该模块标记编码红色荧光蛋白的m RNA,构建了RFP-3WJ-4Corn。该质粒可用于在活细胞中对m RNA及其蛋白产物进行长时间的成像与示踪。使用这种方法,我们在He La细胞中对m RNA的出现、转运和翻译进行了实时追踪,追踪时长达20小时。m RNA被观测到从细胞核转运到细胞质中,并且部分定位于内质网,蛋白产物RFP的信号初期与m RNA信号共定位,随后弥散分布与细胞质中。此外,将I_(RFP)/I_(Corn)定义为翻译表达水平系数可用于对单个细胞的翻译水平进行评估。以上结果表明,RFP-3WJ-4Corn体系适用于对单细胞水平m RNA的翻译过程进行长时程的检测和示踪。 |
| 语种 | 中文 |
| 源URL | [http://ir.sinap.ac.cn/handle/331007/33889]  |
| 专题 | 中科院上海应用物理研究所2021-2022年 |
| 作者单位 | 1.中国科学院上海应用物理研究所 2.中国科学院大学; |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 刘文晗. 基于荧光点亮RNA适配体的RNA活细胞成像研究[D]. 中国科学院大学(中国科学院上海应用物理研究所). 2021. |
入库方式： OAI收割
来源：上海应用物理研究所
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