动物细胞大规模高密度培养相关技术的研究－尿型纤溶酶原激活剂的中试生产
文献类型：学位论文
| 作者 | 胡显文 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2001-07 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 李佐虎 ; 肖成祖 |
| 关键词 | 大规模高密度细胞培养 动物细胞反应器 氧容量传递系数 无泡通气 多孔微载体 尿型纤溶酶原激活剂 无血清培养基 溶氧 细胞长期培养 周期压力振荡 |
| 其他题名 | Some techniques related to large-scale and high-density animal cell culture--Pilot production of urine-type plasminogen activator |
| 学位专业 | 细胞工程 |
| 中文摘要 | 动物细胞技术（Animal cell technology），有时也称细胞工程C Cytotechnology），是生物技术领域中重要的组成部分，它是利用动物细胞体．外培养和扩增来生产生物产品，或者作为发现和测试新药的工具。大规模动物细胞培养技术己经广泛应用于生物高技术产业，用动物细胞大规模培养技术生产的生物制品包括单克隆抗体、病毒疫苗、干扰素、t－PA, EPO,凝血因子、C－CSP,融合蛋白（如Enbrel）、组织工程产品及其他生物制品。为了提高反应器的生产效率，降低运行成本，理想的商业用工业化的动物细胞培养工艺应具有以下特点：“大规模、高密度、长时间、高表达”。本文主要围绕这一目标，开展了动物细胞大规模培养相关技术的研究。动物细胞的高密度培养，氧传递速率是一个限制因素。动态法测定了30升Biostat UC硅胶管无泡通气反应器的容量传递系数（KLa）。反应器的氧传递速率COTR）随搅拌转速、硅胶管内部压力及供氧气体中氧的浓度的增加而增加，而气体中氧的浓度对氧传递速率的影响最明显，通气率对KLa的影响很小。以空气作为供氧气体，反应器的KLa值一般在0.7h~(-1)-1.4h~(-1)之间。在相似条件下，以纯氧作为供氧气体比空气作供氧气体的氧传递速率高7-8倍。在培养基中测定的KLa值比在蒸馏水中测定的值小10%左右。与细菌等比较，动物细胞无细胞壁，个体较大，大规模培养时易受到各种流体一机械剪切力等带来的机械损伤。采用多孔微载体培养细胞，由于细胞生长在其内部，可为细胞创造良好的微环境，细胞生长不受流体流动、机械搅拌和气体喷射的影响。利用α-纤维素研制了适合细胞生长的多孔微载体。将纤维素铜氨溶液喷洒至-40℃的硅油：正已烷＝1：4的冷冻·液中形成含冰晶的微球，用-30℃、40%的H_2SO_4再生纤维素，并用DEAE盐酸盐修饰其表面，制成适合动物细胞培养的纤维素多孔微载体。利用该微载体培养能分泌尿型纤溶酶原激活剂（u-PA）的重组CHO细胞，在100m1搅拌瓶中换液培养25天，细胞最高密度为6.3 * 10~6/ml,尿型纤溶酶原激活剂最高活性为2325 IU/ml,共获28.7mg产品。之后转入1000ml搅拌瓶中培养，可观察到细胞可从种子微载体中自动转移到新微载体中生长繁殖直至所有微载体中都长有细胞。在25天二级培养中，细胞最高密度为7.3 * 10~6/ml，尿型纤溶酶原激活剂最高活性为3108 IU/ml，共获含353mg尿型纤溶酶原激活剂的上清13.7L.在培养后期换用无血清培养基培养，细胞生长及蛋白表达水平正常。用含血清培养基生产生物制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标，因此，大规模生产临床使用的生物制品应尽可能使用无血清培养基。在30升搅拌式反应器中用多孔微载体培养分泌尿型纤溶酶原激活剂的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞（rCHO），研究了多孔微载体浓度、血清浓度及溶氧对细胞生长和表达的影响。结果表明：微载体浓度为3-4 g/L时，细胞培养密度可达2.6 X 10~7 cells/ml在2 * 10~5 cells/ml低密度接种条件下，使用低（无）血清培养基会延长细胞生长延滞期并降低比生长速率，而细胞密度大于10~6cells/ml时，血清浓度对细胞生长和产物表达的影响没有显著差别。溶氧（DO）维持在20%-45％时，对细胞表达产物和葡萄糖代谢无明显影响，但溶氧降至7％-9％时，细胞表达水平明显降低，葡萄糖代谢转化为乳酸的比例上升。在 30L Biostat UC反应器中利用纤维素多孔微载体培养了分泌u-PA的重组CHO细胞。在利用旋转滤器截留细胞的26天连续培养过程中，细胞最高密度可达1.33* 10~7cells/ml,上清中u-PA的最高活性为7335 IU/ml,共获得含7.1 g u-PA的上清204L.为了克服旋转滤器长期培养易于堵塞的缺点，研制了可反冲细胞截留系统，在100天使用0.1%的血清培养基培养细胞过程中，细胞密度大于1/cells/ml,收集了含有Slg产品的上清1604L.与灌流培养比较，批式换液连续培养方式可以为细胞提供较好的生长环境，并且减少不稳定的分泌产物在370C溶液环境下的降解，保证了产品质量。细胞可以在多孔微载体间自动转移，使逐级放大培养安全方便。为延长培养时间和减小大规模高密度细胞培养过程中的细胞凋亡，开发了一种新的动物细胞大规模培养的工艺。在3OL搅拌式反应器中无血清培养分泌尿型纤溶酶原激活剂u-执的DNA重组CHO细胞，定期部分更换Cytopore多孔微载体，使生长在多孔微载体中的细胞不断更新繁殖，改善多孔微载体中的细胞与培养基之间的传质性能，保持长期培养过程中细胞的活力，以及在一定程度上恢复由于密度效应下降的细胞表达水平。在91天的连续培养过程中，细胞最高密度可达2.6 * 10~7/ml，活细胞的比例一直大于90％，收获上清中u-PA的最高浓度约110mg/L，共收获含114.66克-u－PA（单链比例约90%）的上清1827升。采用多孔微载体培养细胞时，当微载体内部长满细胞后，处于微载体中心的细胞可能会由于传质阻力增加而降低表达水平，增加葡萄糖通过厌氧代谢途径生成乳酸的比例。在7.5L反应器中培养表达u-PA的重组CHO细胞时，在培养体系中引入振幅为0.04 MPa、频率为0.04 Hz的周期压力振荡，来改善传质性能，引进外部物理刺激。结果表明，与常压操作相比，周期压力振荡不会影响细胞的比生长速率，但是能够提高高密度条件下细胞的表达水平约10%-40%,减小葡萄糖厌氧代谢成乳酸的比例约10%-30%.在67天的连续无血清培养过程中，细胞最高密度可达2.64 * 10~7/ml，上清中u-PA的最高浓度可达约118mg/L，共收集含21.1g u-PA的上清313升。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-26 |
| 页码 | 138 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1913]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 胡显文. 动物细胞大规模高密度培养相关技术的研究－尿型纤溶酶原激活剂的中试生产[D]. 中国科学院研究生院. 2001. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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