聚乙二醇修饰蛋白质与相关分析分离方法
文献类型：学位论文
| 作者 | 李伟军 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2001-04 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 导师 | 苏志国 |
| 关键词 | 聚乙二醇 化学修饰 蛋白质 |
| 其他题名 | Protein modification with polyethylene glycol and related analytical and separation techniques |
| 学位专业 | 生化工程 |
| 中文摘要 | 用生物相容的聚合物—聚乙二醇（PEG）共价修饰蛋白质具有重要的生物医学意义。已有大量研究报道了PEG化蛋白质的药理学与病理学特点，但在被修饰蛋白质的分析表征，修饰过程理论，修饰前后的生化性质变化，以及被修饰蛋白质的分离纯化等方面尚需做大量工作。本论文围绕这几方面作了初步探索。用城拍酞亚胺活化醋法和N，N一拨基二咪哇法对PEG进行活化，分别制备了单甲氧基唬拍酞亚胺聚乙二醇(MPEG一55）与单甲氧基咪哇基聚乙二醇C MPEG一CDI )两种活化产物，活化度均为80%左右。以这两种PEG衍生物为修饰剂对本文涉及的蛋白质进行修饰。用三硝基苯磺酸（TNBS）法、SDS一PAGE,毛细管电泳、反相高效液相色谱和基体辅助激光解吸电离时间飞行质谱等五种方法分析了PEG化蛋白质的修饰程度和偶联不同PEG链的蛋白质组分分布，对不同方法作了比较。重点对毛细管电泳分析PEG化蛋白质的电泳体系作了改进。提出了半亲水毛细管电泳的概念。首次采用含50% (vlv)乙睛的半亲水毛细管电泳体系分析PEG化蛋白质和普通蛋白质，分析效果优于同等条件下的亲水毛细管电泳体系。提出采用低碳链长的C。反相高效液相色谱柱结合非线性梯度洗脱条件分析PEG化蛋白质。高效液相色谱、质谱与毛细管电泳的分析图谱一致，可以相互验证。进行了毛细管电泳定量研究PEG修饰蛋白质反应的新探索。蛋白质平均修饰度随着PEG修饰剂与蛋白质摩尔比例的增大而增大。当以MPEG一SS为修饰剂时，缓冲液pH对蛋白质的修饰度有重要影响；最适pH为7.4一8.4,此时蛋白质修饰度较高，且在溶液中较稳定；过高的pH值会导致PEG化蛋白质在反应后脱掉PEG链。MPEG一55修饰蛋白质的反应过程在0.5 h内完成。提出了一种串联二级反应动力学模型，用于描述MPEG一SS修饰蛋白质的反应机理与动力学过程，模型推导结果与实验值一致。论文在上述实验基础上，选择了三种不同生化性质的目标蛋白进行了PEG修饰的具体探索。以牛胰核糖核酸酶A（RNase）为对象，考察了MPEG一S SIRNase摩尔配比对PEG化RNase催化酵母RNA降解活性的影响。研究了温度、pH,阳离子、变性剂、蛋白酶降解等环境因素对PEG化RNase酶活性的影响。在较高温度作用（870C以上）、阳离子作用和蛋白酶消化作用下，PEG化RNase都比天然RNase稳定。以2’，3’-环磷酸胞嗜淀为作用底物，测定了PEG化RN佩ase的酶动力学参数Km和Vm。通过MTT实验发现PEG化RNase对人白血病K562细胞有明显细胞毒性，这是天然RNase不具备的性质。以基因重组型人肿瘤坏死因子-a（rhTNF-a）为对象进行了PEG修饰。探索了一条从rhTNF-a的发酵、提纯、修饰到药物质量控制，生物活性测定等工作的较为完整的工艺路线。实验发现相对于天然rhTNF-。，PEG化rhTNF-a的体外细胞毒性随着PEG修饰程度的增大而逐渐降低，但PEG化rhTNF-a抵抗蛋白酶降解的能力增强，且随着修饰度的提高其抵抗能力越强。PEG rhTNF-a，经碱水解脱去PEG链可提高其细胞毒性。可以从药物释放途径的角度解释PEG化rhTNF-a体外活性下降和体内活性增加之间的矛盾。以牛血红蛋白(Hb)为对象进行了PEG修饰，探索了修饰后产物的分离。提出采用流通式的强阳离子交换层析分离了PEG化Hb产物，以“负吸附”方式除去大部分未修饰的Hb杂质。凝胶过滤层析可作为精制手段进一步纯化PEG化Hb a凝胶过滤可与毛细管电泳一起对PEG化Hb产物进行分析，反过来指导阳离子交换层析分离的参数优化。 |
| 语种 | 中文 |
| 公开日期 | 2013-09-26 |
| 页码 | 168 |
| 源URL | [http://ir.ipe.ac.cn/handle/122111/1915]  |
| 专题 | 过程工程研究所_研究所（批量导入） |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 李伟军. 聚乙二醇修饰蛋白质与相关分析分离方法[D]. 中国科学院研究生院. 2001. |
入库方式： OAI收割
来源：过程工程研究所
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