文蛤（Meretrix petechialis）是我国重要的海产经济贝类。由于滩涂环境和气 候变化，在养殖过程中时有规模性死亡发生，给养殖产业带来严重的经济损失。 文蛤的规模性死亡多发生在夏季高温期，同时夏季也是文蛤的生殖季节。因为动 物的生殖和对病原的免疫响应都是高能量需求过程，因此文蛤生殖与免疫力之间 可能存在权衡。本研究针对贝类夏季死亡这一问题，选取生殖前后的文蛤亲本进 行了转录组和蛋白组学分析，解析生殖过程对免疫能力和物质能量代谢的影响。 另外，通过攻毒实验多角度探究了高温和弧菌病原对文蛤生存、免疫功能、氧化 应激以及对凋亡自噬的影响。基于组学数据，选取受生殖影响的 TLR 信号通路， 分析了其免疫功能和作用分子机制。本研究的主要结果如下：

1、为了研究繁殖过程对文蛤免疫的影响，我们选取生殖前后文蛤样品进行 了转录组和基因表达分析。基于 BGISEQ-500 测序平台共得到 48339 条 unigenes。 雌性生殖前后比较组（Pre_F-vs.-Post_F）共检测到差异基因（DEGs）1805 个， 而雄性生殖前后比较组（Pre_M-vs.-Post_M）共检测到 2488 个 DEGs。对 DEGs 进 行 KEGG 富集分析，显示雄雌共有的免疫信号通路在生殖后发生了改变，包括 IL-17 信号通路、TLR 信号通路、RIG-I 样受体信号通路和 NOD 样受体信号通路 等。通过 Nr 注释进一步筛选了 22 个免疫相关的 DEGs，它们分别来自补体与凝 血级联通路、细胞凋亡通路、TLR 信号通路、NF-κB 信号通路、白细胞跨内皮 迁移通路和 MAPK 信号通路等。进一步分析发现，雌性产卵后凋亡、TLR 信号 通路和热休克相关基因表达上调，而雄性生殖后补体相关基因表达下调。另外， 我们对产卵前后文蛤进行了攻毒实验，检测了四个基因（ARAF-like，CREM， TLR4 和 TBK1）在弧菌感染下生殖前/后的表达情况，发现雄雌蛤生殖后对弧菌 刺激的免疫应答水平均有上调。利用两个标记基因 DOUX 和 MITF 进一步评价 了文蛤生殖前、后样品在弧菌攻毒条件下的免疫状况，发现生殖后样品中 DOUX 和 MITF 在转录和蛋白水平上显著上调，进一步证实生殖影响了文蛤对病原菌刺 激的免疫响应水平。上述结果为探究生殖对文蛤免疫影响的分子机制提供了新认 知。

2、由于繁殖需要大量的能量投入，因此繁殖对代谢的影响日益受到关注。 本研究采用蛋白质组学方法，获得了雌性和雄性文蛤生殖前后的肝胰腺蛋白质组 数据。基于 iTRAQ 分析共得到 5,192 个蛋白，其中分别在雌性和雄性生殖前/后 样品检测到 42 个和 37 个差异蛋白（DEPs）。通过 KEGG 通路分析，探讨了获 得的 DEPs 的功能，结果表明生殖对代谢过程有重要影响。雌性糖原去分支酶 （AGL）、雄性甘露糖-6-磷酸异构酶（MPI）、β-葡萄糖苷酸酶（GUSB）和乙 醛酸酯/羟丙酮酸酯还原酶（GRHPR）在生殖后降低，意味着生殖后碳水化合物 代 谢 减 弱 。 雌 性 醛 脱 氢 酶 （ NAD+ ） 生 殖 后 上 调 ， 雄 性 Meprin B 、 Cysteine-S-conjugateβ-lyase 裂合酶生殖后表达增加，提示生殖使得蛋白质和氨基 酸代谢增强。此外，谷胱甘肽转移酶/脱氢酶（DHAR）和谷胱甘肽 S-转移酶（GST） 在雌性生殖后个体上调，而在雄性生殖后个体下调，说明生殖导致雌性比雄性更 严重的氧化损伤。雌性的两种肌钙蛋白 troponin 和 myosin 以及 EFHD2 在生殖后 的表达下调，说明生殖可能会减弱雌性的肌肉功能。进一步实验显示，总葡萄糖 和蛋白质含量在生殖后短暂增加，然后恢复到基线水平。研究结果有助于更好地 理解文蛤在繁殖过程中能量变化特征及其分子机制。

3、为了探究热应激如何影响文蛤免疫系统对细菌感染的响应，我们在夏季 正常海水温度（27℃）和接近热应激温度（31℃）条件下，开展了文蛤副溶血弧 菌感染实验。分别设置了 27℃非感染组（27℃-control）、27℃弧菌感染组 （27℃-vibrio）、31℃非感染组（31℃-control）和 31℃弧菌感染组（31℃- vibrio） 等四组实验。结果表明，副溶血弧菌感染和温度都会影响死亡率，是否感染弧菌 决定了死亡事件的有无；而在感染的前提下，温度的高低又决定了死亡率的高低。 对免疫相关基因的表达模式进行 PcoA 分析，表明弧菌感染在潜伏期的影响起主 导的，随着感染的进程弧菌感染和温度的影响逐渐均衡。采用 TaqMan 技术进一 步分析发现，在适宜环境的个体（27℃-control）对肝胰腺中的弧菌清除的能力 显著高于其他组。我们进一步探究了温度和弧菌感染对凋亡和自噬的影响，结果 显示潜伏期（3d）温度和病原感染会使文蛤抗自噬和抗凋亡能力上调，而恢复期 （8d）温度升高和病原感染会降低其抗凋亡和抗自噬的水平。最后分析了温度和 弧菌感染对机体抗氧化酶活性的影响，结果显示，27℃-control 组中 MDA、GSH 和SOD 的含量显著低于其他 3 组，MDA 和 GSH 含量在 31℃-control、27℃-vibrio 之间没有差异，但显著高于 27℃-control，且显著低于 31℃-vibrio 组，表明单独 的温度或病原体刺激会对机体产生相似的氧化刺激，在两种因素的共同作用下， 会对机体产生显著叠加的应激作用。上述结果探究了水温和机体抗感染免疫的关 系，为解释贝类在夏季高温时期的规模性死亡提供了依据。

4、转录组数据提示 TLR 通路在繁殖前后发生变化，而 Toll-like 受体是经典 TLR 信号通路的关键分子，在免疫、生殖等方面具有重要意义。在本研究中， 我们鉴定了文蛤的 MpTLR 和 MpMyD88 的 ORF 序列，预测的 MpTLR 蛋白具有 N 端 EGF 结构域和 C 端 TIR 结构域；MpMyD88 具有 N 端 DEATH 结构域和 C 端 TIR 结构域。进化分析表明，文蛤与 Mizuhopecten yessoensis 和 Pecten maximus 聚为同一支，这暗示了 MpTLR 和其他贝类具有同源性。MpTLR 的组织分布分 析表明，MpTLR 在肝胰腺、闭壳肌、鳃、性腺和外套膜均有高表达。LPS 和 polyI:C 刺激后，MpTLR mRNA 表达显著上调，提示其参与了文蛤的免疫应答。此外， 敲低 MpTLR 后，MyD88，BCL2，MAPKK 和 IκB 的 mRNA 表达量显著降低， 而 TBK1 和 NF-κB 的 mRNA 表达量无明显变化，提示 MyD88，BCL2，MAPKK 和 IκB 是受到 MpTLR 调控的下游靶基因。最后，我们发现 MpTLR 可以调控 NF-κB 从细胞质转移到细胞核内。上述结果为进一步研究 TLR 通路在文蛤繁殖 和免疫中的功能提供了基础。

第一章 引言..................................................................................................................... 1 1.1 文蛤生物学及养殖现状.......................................................................................... 1 1.2 文蛤的生殖................................................................................................................ 2 1.3 文蛤的免疫防御....................................................................................................... 3 1.3.1 贝类的病害............................................................................................................... 3 1.3.2 贝类免疫的特点......................................................................................................5 1.3.3 贝类主要的免疫通路.............................................................................................7 1.4 文蛤的代谢..............................................................................................................16 1.4.1 碳水化合物代谢....................................................................................................16 1.4.2 脂代谢...................................................................................................................... 17 1.4.3 蛋白质或氨基酸代谢.......................................................................................... 18 1.5 生殖、代谢和免疫的权衡....................................................................................18 1.5.1 生殖与免疫的权衡...............................................................................................19 1.5.2 生殖与代谢的权衡...............................................................................................19 1.5.3 温度对免疫的影响...............................................................................................20 1.6 本研究的内容和意义..................................................................................................21

第二章 生殖过程对文蛤免疫影响的转录组分析..........................................................22

2.1 研究背景.................................................................................................................. 22 2.2 材料方法.................................................................................................................. 23 2.2.1 实验动物..................................................................................................................23 2.2.2 RNA-Seq 和数据分析..........................................................................................23 2.2.3 差异表达基因（DEGs）分析...........................................................................24 2.2.4 弧菌攻毒和样本采集.......................................................................................... 24 2.2.5 qPCR 分析...............................................................................................................25 2.2.6 蛋白质印迹分析....................................................................................................26 2.3 结果........................................................................................................................... 27 2.3.1 序列组装和注释....................................................................................................27 2.3.2 差异基因（DEG）分析及免疫相关通路鉴定.....................................................28

2.3.3 生殖前后免疫相关基因表达差异................................................................... 31 2.3.4 弧菌感染下文蛤生殖前/生殖后基因表达变化..........................................33 2.3.5 弧菌感染下文蛤免疫状况评估........................................................................34 2.4 讨论........................................................................................................................... 35 第三章 生殖过程对文蛤代谢影响的蛋白组分析..........................................................38

3.1 研究背景................................................................................................................... 38 3.2 材料方法.................................................................................................................. 39 3.2.1 实验动物..................................................................................................................39 3.2.2 蛋白组测定.............................................................................................................39 3.2.3 蛋白定量和 iTRAQ 数据分析.......................................................................... 39 3.2.4 生物信息学分析....................................................................................................40 3.2.5 生殖恢复期葡萄糖和蛋白代谢的测定.......................................................... 40 3.3 结果........................................................................................................................... 40 3.3.1 生殖前后的蛋白质组.......................................................................................... 40 3.3.2 生殖影响的代谢相关 KEGG 通路.................................................................. 41 3.3.3 生殖后碳水化合物代谢减弱.............................................................................43 3.3.4 生殖后蛋白质和氨基酸代谢增强................................................................... 44 3.3.5 与肌肉运动和氧化应激相关的蛋白质的变化............................................ 44 3.3.6 葡萄糖和蛋白质含量在生殖过程中短暂上升后恢复到产前水平................... 45

3.4 讨论........................................................................................................................... 46 第四章 生殖季节高温和弧菌感染对文蛤免疫的影响................................................. 49

4.1 研究背景.................................................................................................................. 49 4.2 材料方法.................................................................................................................. 50 4.2.1 实验动物..................................................................................................................50 4.2.2 DNA 提取、RNA 提取和 cDNA 的获得......................................................51 4.2.3 TaqMan 检测肝胰腺组织中的载菌量............................................................51 4.2.4 qPCR 与 PCoA 分析............................................................................................ 52 4.2.5 蛋白印迹分析........................................................................................................ 53 4.2.6 氧化应激水平的检测.......................................................................................... 53 4.3 结果........................................................................................................................... 53 4.3.1 温度和弧菌共同影响文蛤的生存能力................................................................ 53

4.3.2 文蛤肝胰腺组织中的弧菌载菌量变化分析.................................................54 4.3.3 温度和弧菌影响条件下免疫基因表达模式的 PcoA 分析.......................55 4.3.4 温度和弧菌感染对凋亡和自噬的影响.......................................................... 57 4.3.5 温度和弧菌感染对机体氧化应激的影响.............................................................58

4.4 讨论........................................................................................................................... 59 第五章 文蛤受生殖影响的关键免疫通路 TLR 的研究................................................63

5.1 研究背景.................................................................................................................. 63 5.2 材料方法.................................................................................................................. 64 5.2.1 实验动物..................................................................................................................64 5.2.2 实验引物..................................................................................................................64 5.2.3 RNA 提取和 cDNA 的合成...............................................................................65 5.2.4 MpTLR-ORF 获得和序列分析.........................................................................65 5.2.5 MpTLR 对不同刺激物的响应实验................................................................66 5.2.6 qPCR.........................................................................................................................66 5.2.7 RNA 干扰实验.......................................................................................................66 5.2.8 蛋白印迹分析实验...............................................................................................67 5.2.9 酵母双杂实验........................................................................................................ 67 5.3 结果........................................................................................................................... 68 5.3.1 MpTLR 和 MpMyD88 基因序列分析............................................................ 68 5.3.2 MpTLR 组织分布................................................................................................. 70 5.3.3 MpTLR 对不同病原的响应分析......................................................................70 5.3.4 MpTLR 下游靶基因筛选................................................................................... 71 5.3.5 MpTLR 对 NF-κB 调控模式的研究................................................................73 5.3.6 体外 MpTLR 和 MpMyD88 无直接相互作用............................................. 74 5.4 讨论........................................................................................................................... 74 结 论.................................................................................................................................. 79 参考文献............................................................................................................................. 81 附 录................................................................................................................................111 致 谢................................................................................................................................119作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果........................................... 121