牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一种重要的水产养殖鱼类，在亚洲东部等地区大规模养殖。肿大细胞病毒（megalocytivirus）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是牙鲆等许多养殖鱼类的严重病原。本研究对肿大细胞病毒感染后的牙鲆脾脏进行全转录组测序，通过生物学信息分析并结合实验对病原诱导的编码RNA和非编码RNA进行了系统鉴定、免疫功能分析以及抗感染免疫作用研究。另外，本研究还对迟缓爱德华氏菌感染后的牙鲆进行了脾脏全转录组测序，分析了迟缓爱德华氏菌以及肿大细胞病毒共诱导的miRNA。

通过对肿大细胞病毒感染的牙鲆脾脏转录组数据分析，我们在感染后2、6和8天分别鉴定到225、275和877个差异表达基因（DEG）。其中，728个DEGs的表达量显著上调，659个DEGs的表达量显著下调。大多数DEGs的表达具有时间特异性，并形成四种不同的表达模式。Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）功能富集分析显示DEGs参与多个信号通路，其中约三分之一与免疫相关。通过加权共表达网络分析（WGCNA）筛选到了16个关键免疫DEGs，其共参与7个免疫通路，这些通路之间存在广泛的相互作用，形成复杂的调控网络。

随后，通过对肿大细胞病毒感染的牙鲆脾脏小RNA组数据进行分析，共鉴定了1,327个microRNAs（miRNAs），其中171个miRNA（命名为DEmiRs）在病毒感染期间以时间依赖性的方式表现出明显的差异性表达。基于靶基因预测软件分析结果，共有805个基因（命名为DETmRs）被预测为DEmiRs的靶基因，其表达量不仅在病毒感染后发生显著性变化，且与目标DEmiRs的表达量呈负相关。通过对免疫相关的DETmRs及其目标DEmiRs的综合分析，确定了12个关键DEmiRs，它们与相应的DETmRs一起形成了包含84个DEmiR-DETmR关系对的调控网络。此外，19个DEmiRs靶向上述转录组分析结果中的6个关键免疫DEGs，共同形成了由21个miRNA-mRNA关系对组成的调控网络。通过对测序数据进一步分析，鉴定了9,434个环状RNA（circRNA），其中169个circRNA（命名为DEcircRs）在肿大细胞病毒感染期间表现出显著差异表达以及时间依赖性。通过对DETmR-DEmiR和DEcircR-DEmiR相互作用进行综合分析，构建了竞争性内源RNA（ceRNAs）调控网络，该网络由参与抗病毒免疫的circRNA、miRNA和mRNA三联体构成。

MiRNAs在抗感染免疫中发挥重要作用，其通过调控靶基因的转录后表达，广泛参与鱼类多种免疫过程。基于全转录组数据分析结果，我们鉴定了肿大细胞病毒和迟缓爱德华氏菌共诱导的miRNA，并且针对其中一个miRNA（miR-29-x）开展了免疫功能研究。结果表明，miR-29-x的靶基因为claudin 4（CLDN4）。qRT-PCR检测发现miR-29-x和CLDN4的表达量在病原感染后均发生显著变化，且变化趋势呈负相关。CLDN4是五次跨膜蛋白，通过激光共聚焦显微镜观察发现CLDN4在细胞质膜上表达。CLDN4蛋白有三段序列暴露于细胞膜外，分别命名为E1、E2和E3，其中E2对于CLDN4的胞内定位具有重要影响。CLDN4胞外段E3对应的小肽具有与多种细菌结合的能力以及对Vibrio anguillarum的杀伤能力。另外发现，过量表达CLDN4能够增加迟缓爱德华氏菌对细胞的粘附作用。

综上所述，我们从mRNA、miRNA及circRNA等多层次对肿大细胞病毒诱导的牙鲆RNA进行了鉴定分析和研究，发现编码RNA和非编码RNA深度参与牙鲆抗感染免疫，揭示了一个肿大细胞病毒和迟缓爱德华氏菌共诱导的miRNA的靶基因的抗感染免疫作用。这些研究结果加深了我们对鱼类RNA免疫功能和免疫机制的理解，也为鱼类病毒和细菌病的免疫防控提供了理论指导。R