疫苗被认为是预防和控制病毒性疾病最简便和最有效的方法。佐剂是疫苗产品中不可缺少的，它能增强抗原免疫原性，能够使机体产生更强的免疫应答，进而起到增强免疫效果、降低疫苗剂量以及减小生产成本的作用。一种理想的佐剂不仅能够使疫苗具有较强的免疫原性，而且要具有生产成本低廉、无毒、生物相容性好且稳定性强保质期长的特点。现有佐剂虽然种类众多但均存在各种不同缺点，如会造成机体局部毒性或免疫原性增强差，表现出明显的局限性，因此亟需开发更为理想、高效的疫苗佐剂。在过去的几十年中，纳米颗粒作为免疫原传递的佐剂引起了人们的广泛关注，由于其超小的体积在介导细胞渗透、保护抗原在生物介质中不被降解、将抗原输送到靶点并进行控制释放，从而增强免疫应答等方面具有许多诱人的优点。本文基于水溶性壳聚糖为载体，通过衍生化并制备新型纳米颗粒，希望获得一种在生理溶液中生物相容性和稳定性高的新型佐剂材料。

具体内容包括：制备不同分子量的壳聚糖，利用其2,3,6位的氨基和羟基三个活性位点，得到不同分子量的阴离子，如硫酸化、羧甲基化，和阳离子，如季铵化壳聚糖衍生物，通过衍生物所带电荷和电性不同，采用聚电解质复合法制备负载不同抗原的纳米粒，研究纳米粒负载抗原后的体外及体内免疫活性，研制具有较强免疫刺激能力以及抗原载体功能的新型壳聚糖衍生物纳米佐剂。主要研究结果如下：

1. 采用专一性酶法降解壳聚糖，获得分子量为200 kDa，50 kDa，5 kDa，3 kDa，1 kDa的壳聚糖和壳寡糖。将这一系列壳聚糖进行特定位点衍生化，得到了不同分子量不同取代位点的三类壳聚糖衍生物：阴离子型的羧甲基壳聚糖、硫酸酯壳聚糖以及阳离子型的季铵盐壳聚糖，并通过红外、核磁等对其结构进行了表征。

2. 利用壳聚糖衍生物所带电荷和电性不同，采用聚电解质复合法制备了不引入交联剂的多糖纳米粒材料。主要为不同分子量和取代位点的硫酸酯-季铵盐壳聚糖和羧甲基-季铵盐壳聚糖负载不同抗原的纳米粒及不负载抗原的空纳米粒。对纳米粒粒径、电位、分散度以及对抗原的负载率等进行了测定。结果证明，所制备纳米粒呈球形，粒径在152.33-332.90 nm，电位在17.10-40.60 mV，多分散性指数PDI为0.009-0.310，负载率高于65 %，且在一周时间内缓慢将抗原释放出来。说明纳米粒具有较好的分散性、稳定性、释放率以及较高的负载率。

3. 研究了空心纳米粒及负载抗原的纳米粒对树突状细胞（DCS）的免疫刺激活性。细胞毒性测定结果表明，空心纳米粒在≤100 μg/mL，负载抗原纳米粒在≤100 μg/mL没有细胞毒性。免疫活性结果表明，分子量为200 kDa的2,3,6位、3,6位取代的硫酸酯-季铵盐壳聚糖、N,O取代的羧甲基-季铵盐壳聚糖、N取代的羧甲基-季铵盐壳聚糖和50 kDa的6位取代的硫酸酯-季铵盐壳聚糖负载抗原的纳米粒可显著促进IL-6, TNF-α, IL-1β等免疫因子的表达及DCS细胞表面膜蛋白MHC-ΙΙ、CD80、CD86、CD40、CD11c的分泌量增加，增强抗原呈递作用。对纳米粒进行了细胞摄取实验测定，发现负载抗原的纳米粒随着时间增加均能够被DCS细胞摄取，而200 kDa 2,3,6-硫酸酯-季铵盐壳聚糖纳米粒和N,O-羧甲基-季铵盐壳聚糖纳米粒能够更好的被DCS细胞摄取。这两种纳米粒对DCS细胞信号通路的影响研究发现，它们能更好的激活DCS细胞中PI3K和MAPK通路，进一步激活JAK/STAT通路，促进核转录因子进入核内，从而促进细胞因子的表达，而发挥免疫作用。

4. 根据筛选结果，对2,3,6-硫酸酯-季铵盐壳聚糖、N,O-羧甲基-季铵盐壳聚糖和肝素-季铵盐壳聚糖负载OVA的纳米粒进入更进一步的动物实验研究，结果表明纳米粒能够显著促进小鼠分泌IgG1免疫球蛋白，对IgG2免疫球蛋白影响较小，且能够促进小鼠分泌IL-17、IL-4和IL-6免疫因子。对小鼠的肝肾脾进行病理切片观察，结果表明所制备纳米粒对动物器官没有损害，安全性好。

综上所述，体内、体外试验结果均表明新型壳聚糖衍生物纳米粒可促进抗原增强免疫活性，为开发新型佐剂奠定了基础。