DNA 甲基转移酶缺陷大肠杆菌构建及抗生素毒性研究
文献类型:学位论文
作者 | 陈政 |
答辩日期 | 2021-06 |
文献子类 | 博士 |
授予单位 | 中国科学院大学;中国科学院生态环境研究中心 |
授予地点 | 北京 |
导师 | 汪海林 |
关键词 | ΛRE. 重组系统,大肠杆菌,基因敲除,抗生素,Dna 甲基化 lamda RE. RE.ombination SystE., E. Coli, gE.E.Knockout, Antibiotic, Dna mE.hylation |
学位名称 | 理学博士 |
学位专业 | 环境科学 |
其他题名 | Study on Construction and Antibiotic Toxicity Profiles of Escherichia coli Strains Lacking DNA Methyltransferases |
英文摘要 | 随着 DNA 甲基化修饰检测分析技术的发展,研究者们发现 N 6 -甲基腺嘌呤 (6mA)这一广泛存在于原核生物体内的 DNA 甲基化修饰,在诸如果蝇、莱茵衣 藻、线虫等真核生物体内也以较低的含量存在,并且参与基因表达、激活等重要 的生物学过程。然而,介导真核生物基因组 DNA 6mA 生成的甲基转移酶还有待 进一步鉴定和研究。使用体外酶活进行甲基转移酶的筛选是一种常用的研究方法, 但是目标蛋白质的高 6mA 背景严重干扰酶活分析和筛选。在原核生物体内,6mA 和 C 5 -甲基胞嘧啶(5mC)是最主要的两种 DNA 甲基化修饰,它们在许多生物过程 中扮演着重要的角色,如限制性修饰系统、碱基错配修复系统、基因组复制调控 等。在抗生素压力下,6mA 和 5mC 对大肠杆菌的存活发挥重要作用。 首先,本文对超低 6mA 蛋白质的大肠杆菌表达和纯化策略进行了研究。以 商业化大肠杆菌菌株 Rosetta (DE3)为亲本菌株,使用改良的 λRed 同源重组系统 构建了 DNA 6mA 甲基转移酶 Dam 缺陷菌株,将新菌株命名为 LAMBS (low adenine methylation background strain)。使用超高效液相色谱串联质谱(UHPLC MS/MS)技术对 LAMBS 的基因组 DNA 6mA 水平进行分析,结果显示 6mA 水平 较亲本菌株大幅降低,为~8/105 (6mA/dA)。使用 LAMBS 和亲本菌株Rosetta (DE3) 同时进行目标蛋白表达,并使用相同的方法进行目标蛋白纯化。凝胶电泳分析结 果表明,使用 LAMBS 表达并结合本文所提出的蛋白质纯化策略能够有效提高目 标蛋白的纯度和浓度。使用 UHPLC-MS/MS 对目标蛋白的 6mA 背景进行分析, 结果显示,经过相同方法纯化后,使用 LAMBS 表达的目标蛋白与在Rosetta (DE3) 中表达时相比具有更低的 6mA 背景,为~8/105 (6mA/dA)。本研究实现了目标蛋 白的超低 6mA 背景,能够有效降低其对 DNA 6mA 甲基转移酶体外酶活分析和 筛选的干扰,为 6mA 相关蛋白的原核表达与体外研究提供了新的工具菌株。 其次,本文进行了抗生素对 DNA 甲基转移酶缺陷大肠杆菌的毒性研究。应 用改良的 λRed 同源重组系统,以大肠杆菌 K-12 MG1655 菌株为亲本菌株,分别 构建了 DNA 6mA 和 5mC 甲基转移酶 Dam 和 Dcm 缺陷菌株,命名为 Δdam 和 Δdcm。通过微量稀释法进行了 5 大类 20 种抗生素的暴露实验,以半数有效浓度 EC50 (50% effective concentration)值的变化来评价抗生素对不同菌株的毒性。结果 显示,几乎全部抗生素对 DNA 甲基转移酶缺陷菌株的 EC50 值均较野生型菌株有 不同程度上的降低,其中阿奇霉素对 Δdam 的 EC50 较其对野生型的降低率达到 了 67.4%,强力霉素对 Δdcm 的 EC50 较野生型的降低了 66.6%。DNA 甲基转移 酶基因敲除导致了抗生素对大肠杆菌的毒性提升,表明靶向 DNA 甲基转移酶的 药物可以作为抗生素佐剂,在一定程度上降低抗生素在使用时的所需浓度,提高 抗生素的杀菌效果,为解决全球性的细菌耐药性问题提供一定的参考。 综上所述,本文以大肠杆菌为模式微生物,应用改良的 λRed 同源重组系统 构建了 DNA 甲基转移酶缺陷菌株,开发了超低 6mA 背景蛋白表达和纯化策略, 用以消除蛋白高 6mA 背景的干扰,对 DNA 甲基转移酶体外酶活分析和筛选有 重要意义。本文开展的抗生素对 DNA 甲基转移酶缺陷大肠杆菌的毒性研究,表 明了 DNA 甲基转移酶可作为抗生素的辅助作用靶点,对减缓抗生素耐药性问题 有重要的参考意义。 |
页码 | 108 |
源URL | [https://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/46979] |
专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 陈政. DNA 甲基转移酶缺陷大肠杆菌构建及抗生素毒性研究[D]. 北京. 中国科学院大学;中国科学院生态环境研究中心. 2021. |
入库方式: OAI收割
来源:生态环境研究中心
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