现代科学技术发展速度惊人，各种新型化合物也随着现代科技的迅猛势头呈 井喷式增加。因此，开发高通量的研究模型成为毒理学研究的当务之急。

       人胚胎干细胞是能自我无限增殖和分化成人体不同谱系细胞的一类细胞。因 此，基于人胚胎干细胞的毒理学检测模型可以高效地对未知物质进行细胞毒性、 胚胎毒性、发育毒性与功能毒性的多方面毒理学评价。同时，相比于动物实验和 常规癌细胞实验，人胚胎干细胞不仅更加贴近人体真实的正常生理状况，也可在 较短时间内进行多种化合物的多靶点检测。由此可见，基于人胚胎干细胞的毒理 学评价模型具有明显的优势。

      在众多新型化合物中，双酚 A 作为一种工业原料，被广泛应用于日常生活 生产中，研究表明其存在内分泌干扰、致癌、引起发育障碍等健康风险。因此， 随着人们对双酚 A 毒性效应研究的逐渐深入，其在多国已被限制使用。然而，替 代双酚 A 应用于工业制造的双酚类化合物却在未经完善的安全评价之前，大量 生产并广泛使用。目前，流行病学研究报告在环境和人体样品中均可检测到多种 双酚类化合物。由此，双酚 A 替代物的健康风险评估亟待完善。

      本文利用基于人胚胎干细胞的多向分化模型即拟胚体分化模型、肝分化模型 与神经分化模型，结合转录组测序技术和高内涵技术，评价了双酚 A 及其六种 替代物（双酚 S、双酚 F、双酚 Z、双酚 B、双酚 E 和双酚 AF）潜在的健康风 险。在研究过程中，本文还优化了干细胞毒理学评价模型，以便更好地筛查未知 污染物的毒性效应。

      本文研究内容主要包含以下四个部分：

       1、双酚类化合物的胚胎发育毒性研究。这部分实验利用拟胚体分化技术， 全面研究双酚类化合物在多向分化系统中对早期胚胎发育的影响。结果显示低浓 度双酚类化合物在拟胚体分化过程中影响部分基因表达和许多生物通路。双酚类 化合物影响的基因数量不同（双酚 S（185）、A（135）、B（131）、E（103）、Z （103）、AF（60）、F（57）），且上调的基因数量超过下调的基因数量。发现主要 受到干扰的效应基因为 APO 家族基因（APOA4、APOC3、APOA2、APOA1 和 APOB）与肝脏标志基因（AFP、FGA、FGB、FGG、TF 和 SERPINA1）。双酚类 化合物还显著影响了胚胎发育过程（Cell Fate Commitment、Embryo Development 等）、脂代谢过程（Cholesterol Metabolism、Lipase Inhibitor Activity 等）、神经发 育过程（Neuron Fate Commitment、Neurogenesis 等）、PPAR 信号通路和 Hedgehog 信号通路。推测双酚类化合物可能有相对特定的效应靶点，在第 3 和 4 章进行相 关定向分化模型进一步探究与验证。综合七种双酚类化合物的毒性效应，双酚 E 影响相对最小，提示双酚 E 未来作为双酚 A 的替代物应用可能相对安全。

      2、双酚类化合物的肝发育毒性研究。由于在拟胚体多向分化模型中发现双 酚类化合物干扰了脂代谢相关基因和通路，且肝脏和脂肪均是脂代谢的主要场所。 因此实验利用转录组数据深入分析肝脏与脂肪组织特异基因和差异表达基因的 变化情况，从而确定了使用肝分化模型对双酚类化合物毒性进行深入探索。实验 发现低浓度双酚类化合物没有显著干扰肝脏标志物基因与蛋白的表达量 （HNF4A、AFP、ALB、FGA、FGB、FGG、PROX1 和 TBX3 等）、及肝实质细胞 功能（脂肪储存）。深入探究发现双酚类化合物可能通过干扰早期胚胎发育阶段 的细胞命运决定，从而导致脂代谢相关基因与通路受到影响，且这些效应主要表 现为 HOX 和 APO 家族基因的失调。强调双酚类化合物对于早期发育阶段的影 响是值得重视的。此外，双酚 E 表现出相对最弱的毒性效应，提示双酚 E 可能 是相对安全的替代物之一。

       3、双酚类化合物的神经发育毒性研究。除对脂代谢影响外，由于在拟胚体 的多向分化实验中发现双酚类化合物对神经发生相关通路有干扰，且前期基于小 鼠胚胎干细胞模型显示双酚 A、S 和 F 会显著影响轴突导向。因此本部分实验关 注双酚类化合物对早期神经发育过程以及神经突发生过程的影响。结果显示，低 剂量双酚类化合物没有明显影响神经发育（SOX1、SOX3、NES 和 PAX6 等）、调 控神经发生的 WNT 与 NOTCH 通路效应基因（AXIN2、LEF1、HES1 和 HES5 等）及细胞骨架相关基因和蛋白（TUBB3、TAU、GAP43 和 CDC42）的表达量， 但会改变神经细胞的形态，即出现神经突长度显著变短、胞体扩大的现象。表明 双酚类化合物可能通过改变神经突长度致使神经系统受损。至此，双酚 A 与其 六种替代物均表现出相似的毒性效应，在神经毒性方面，六种双酚 A 替代物均 不安全。 

       4、优化基于干细胞的毒理学评价模型。由于实验中发现毒理学评价模型可 进行优化以更好适应于高通量多靶点的检测需求，本部分实验优化了三维细胞球 制造、医用材料安全性筛查以及皮肤模型的实验方法。本部分实验发明的一种微 孔模具可用于制备三维立体细胞球，其在细胞实验应用中，可通过改变初始细胞 量控制三维细胞球的尺寸大小，并可使用不同细胞类型（人胚胎干细胞和神经干 细胞）开展不同分化方向实验（拟胚体分化、肝类器官分化和神经球分化），可 适应灵活多变的实验需求。此外，结合细胞形态和细胞活力建立医用材料安全性 的快速初筛方法，单盲实验发现 31 种受试物中，3、12 号聚合物膜材料有明显 细胞毒性、三维多孔结构材料促进细胞增殖。为了进一步评价用于皮肤的医用聚 合物膜，建立并在持续优化基于人胚胎干细胞的皮肤毒性筛查模型，前期数据显 示可在 20 天成功诱导人胚胎干细胞至形态和基因表达相似于角质形成细胞的类 群，表明该模型在皮肤毒性试验中有应用前景。

      综上所述，本文利用人胚胎干细胞的多种分化模型，结合转录组与高内涵技 术平台，着重评价了双酚类化合物的胚胎发育毒性、肝发育毒性和神经发育毒性。 此外，本文还发明了一种可高效稳定制造三维细胞球的微孔模具作为重要的实验 辅助器械、优化了医用材料初筛的实验流程和正在优化的一种皮肤毒性评估模型。 本文实验结果得到的双酚类化合物相关毒理学数据与结论可为双酚类化合物的 规范安全使用提供参考信息，结果显示双酚类化合物双酚 E 可能是一种相对安 全的替代物，但涉及婴幼儿制品，由于七种双酚类化合物均显示类似的神经毒性， 需谨慎使用。同时，本文中基于人胚胎干细胞的发育毒性评价模型和微孔模具可 为未知化合物健康安全评估提供一种稳定且高效的可选方法，助力环境污染物潜 在健康风险筛查技术发展，为环境危害和健康风险的削减提供更多的实验数据参 考。