DNA 分子时刻面临着来自生物体自身或外界环境中多种因素的胁迫作用而 发生 DNA 双链断裂（DSBs）损伤。磷酸化组蛋白 γH2AX 作为 DSBs 的敏感生 物标志物，在研究 DNA 损伤应答机制、预测污染物基因毒性、评估癌症治疗疗 效、开发放射治疗增敏剂等领域均显示了强大的应用潜力。高效、可靠的 γH2AX 检测策略是推进 DSBs 相关研究发展的有效前提。但是，常规的 γH2AX 检测方 法存在检测周期长、操作步骤繁琐、动态检测范围窄、通量低等缺点，因此无法 满足在 DSBs 损伤评估领域应用的要求。

      电化学发光免疫分析法是一种高效的分析方法。因具有简单、快速、灵敏度 高、特异性强的特点，电化学发光免疫分析法在 γH2AX 蛋白的特异性检测方面 具有独特的优势，然而相关研究目前尚未得到开展。此外，报道的电化学发光免 疫分析方法大多基于单独的三电极体系配置，虽然部分研究致力于开发传感阵列 装置并实现了多个样品的同时分析，但检测通量尚不足以满足筛选实验的需求。 在此基础上，本论文通过结合电化学发光免疫分析方法以及实验室自主研制的96 电极微孔板和高通量电化学发光检测仪，建立了两种电化学发光免疫传感阵列， 以实现对 γH2AX 的高通量、灵敏、快速检测。论文的主要内容如下：

      1. 首先，绪论介绍了 DSBs 损伤标志物 γH2AX 的研究进展，通过阐述 γH2AX 检测在 DSBs 相关研究领域中的应用潜力以及常规检测方法的优缺点， 强调了开发 γH2AX 检测新方法的重要性。然后，对电化学发光免疫分析方法的 研究进展进行了综述，包括（1）介绍了三种电化学发光免疫分析模式的基本检 测原理及不同模式的优缺点；（2）以集成配置的角度，结合具有代表性的研究方 法详细地介绍了四种基于电化学发光免疫分析的检测器件的研究进展；（3）论述 了在开发电化学发光免疫分析方法时，为实现目标物灵敏分析可采取的性能提高 策略。以上内容为本课题的开展提供了研究背景以及理论基础。

        2. 开发了一种微孔板式电化学发光免疫传感阵列。该传感阵列以 96 电极微 孔板为反应装置，利用两个配对抗体特异性识别以及三联吡啶钌标记的链霉亲和 素作为报告分子，实现了 γH2AX 蛋白的灵敏检测。在分别对封闭剂浓度、封闭 过程的时间及温度、抗体稀释剂成分、免疫试剂浓度以及免疫反应时间进行优化 后，所构建的传感阵列可特异性响应 2 × 102 – 1 × 105 pg/mL 浓度范围内的 γH2AX 蛋白，并具有优秀的特异性及重现性。在考察了不同细胞裂解液的基质效应的基 础上，此方法完成了对人肝癌细胞 HepG2 样本中 γH2AX 蛋白的有效测定。同 时，利用此方法可检出经拓扑异构酶抑制剂喜树碱、依托泊苷以及强氧化剂过氧 化氢诱导细胞中 γH2AX 水平的显著升高，而非基因毒性试剂氯化钠处理组的蛋 白水平未见明显变化。相比于传统的 γH2AX 检测方法，微孔板式电化学发光免 疫传感阵列由于采用了自主研发的电极微孔板，允许对 96 个样品进行快速测定。 此外，本方法无需复杂的操作步骤，可在 3 h 内完成对细胞样品的检测，为污染 物的体外基因毒性筛选和抗肿瘤药物的药效学评估提供了一个良好的平台。

      3. 开发了一种磁性电化学发光集成高通量传感平台。该平台以免疫磁珠为 固相载体，结合磁性捕获模式与电化学发光检测技术，并采用 96 电极微孔板和 对应的磁铁阵列，实现了对 γH2AX 蛋白的快速定量检测。由于免疫磁珠的使用 为 γH2AX 蛋白的捕获、分离以及免疫反应提供了快速的动力学过程，此方案的 检测时间被缩短至 2 h。在最优实验条件的基础上，电化学发光信号随目标蛋白 浓度的增加而增强，并在 1 – 50 ng/mL 的范围内与 γH2AX 蛋白浓度具有良好的 线性关系。当采用中性亲和素蛋白替代链霉亲和素作为载体并提高三联吡啶钌分 子的标记量时，所开发的磁性电化学发光集成高通量传感平台的检测限可进一步 降低至 0.5 ng/mL。同时，在方法的特异性和重现性考察实验中均获得了令人满 意的结果，免疫磁珠在长达 183 天的保存后对 γH2AX 蛋白仍表现出良好的响应 能力。此外，此方法与微孔板式电化学发光免疫传感阵列同时用于分析细胞裂解 液中 γH2AX 蛋白水平的结果显示，两种方法的检测信号具有一定的相关性，并 且基于免疫磁珠的分离、富集模式可有效增强方法对基质溶液的抗干扰能力。