环境雌激素通过受体介导产生的内分泌干扰效应是广受关注的环境健康问 题之一。目前针对环境雌激素内分泌干扰效应的研究主要集中在经典的雌激素核 内受体（Estrogen Receptor，ER）上，但是已有研究提示天然雌激素引起的一些 下游效应非常快速，表明此效应可不需要经 ER 介导，而是与膜上相应受体即 G 蛋白偶联雌激素受体（G Protein-Coupled Estrogen Receptor，GPER）结合，来激 活相关通路等从而诱导下游信号转导。但受限于匮乏的 GPER 结构生物学信息， 当前对环境污染物经由 GPER 介导的内分泌干扰效应分子机制仍然缺乏认知。 针对这一领域关键科学问题，本论文基于同源建模方法成功构建了 GPER 的三 维结构，通过分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟及分子对接等计算方 法，首先对 GPER 的激活机制、配体的手性影响展开了研究。在此基础上，以典 型双酚类环境污染物（Bisphenols，BPs）为研究对象，对其引发的 GPER 激动/ 拮抗机制进行了原子层面上的探索，并结合必要的体外实验进行验证。

      论文工作主要包含以下四个方面的内容：

      1. GPER 的新配体激活位点与水通道开放机制

      已有研究结果表明配体激活 GPER 会导致跨膜水通道的开放，然而基于报道 的 G 蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）作用位点却无法清晰 诠释 GPER 的配体依赖激活与抑制机制，水通道的关闭和开放调控机制更是无 从谈起。鉴于此，本文以 GPER 的选择性激动剂 G1、内源性配体 E2 以及选择性 拮抗剂 G15 为典型配体，对膜中 ER-配体复合物进行了长程加速分子动力学模 拟。结果显示，激动剂 G1 和 E2 由初始的正构位点向跨膜（Transmembrane，TM） 区深入运动约 10 Å 而后可观察到水通道的形成，而拮抗剂 G15 则稳定于初始位 点且无法开放水通道。与现有 GPER 乃至其他 GPCRs 配体位点比较分析可知， 这一深入跨膜区的作用位点是从未报道的。进一步分析表明，在胞外区附近初始 结合位点结合的 G1 是通过与 Tyr324 和 Trp272 等残基的作用，在极性溶剂化自 由能的驱使下进入更深的跨膜区域中，从而扩大跨膜螺旋 3（TM3）和 6（TM6） 之间的距离并激活 GPER。在激活状态下，GPER 跨膜区水通道被打开并允许连续水分子的跨膜运动，其水通道半径达到 2.21 Å。E2 也可以进入同一新发现的 激活位点并激活 GPER，但 G15 及无配体结合状态的 GPER 则无法产生类似的 变构效应并打开水通道。通过长程加速 MD 模拟分析，第一次获得 GPER 从未 激活到配体结合活化乃至水通道开放的完整动态过程，对全面揭示 GPER 的配 体结合活化机制有推动作用；发现的 GPER 新结合位点可为靶向 GPER 的新药 研发提供必要结构基础。 、

      2. 手性配体与 GPER 作用模式的差异与结构基础

      受体蛋白对手性配体的差异化识别作用机制对认识污染物引发的健康风险 具有重要意义。但目前关于 GPER 与手性化合物的具体作用机制仍然未知。本研 究以 GPER 的选择性激动剂 G1 及其手性异构体 G1’为研究对象，深入探讨了 GPER 对 G1 和 G1’这一对手性异构体的差异化识别过程。模拟结果显示，只有 G1 能够从初始结合的正构位点深入到 GPER 跨膜区激活位点；而 G1’无法进入 位于跨膜区的激活位点，只能与正构位点结合。进一步计算分析构建了 GPER 识 别这一手性异构体的四面体模型，并表明分别位于跨膜螺旋 2（TM2）与跨膜螺 旋 7（TM7）的 Leu108 与 Asn310 是这一识别模型中的关键差异残基。虽然两个 化合物均引发了 TM6 外摆等结构变化并导致 GPER 转变为激动构象，但 G1 比 G1’的变构效应更显著。此外，G1 的结合打开了连续水通道，但 G1’并无此现象。 上述结果提示 G1 可以显著激活 GPER，而 G1’只能部分激活 GPER。

      3. 典型双酚类物质对 GPER 激活作用的结构基础

       双酚类化合物是广受关注的环境内分泌干扰物，有研究提示双酚 A 等典型 双酚类物质既可与 ER 作用，又可与 GPER 结合。已有报道显示 BPA 和 BPAF 等 典型双酚类物质是 GPER 的激动剂；然而双酚类对 GPER 的激活机制仍不清楚。 为了探索双酚类物质结构对 GPER 激活作用的影响，本论文选择分子中连接两 苯环的中心 C 轨道杂化状态和取代情况各异的典型 BPs 物质，对其与 GPER 的 作用情况进行系统的 MD 模拟。其中，双酚 A 作为对照，而双酚 A 中的 sp3 杂 化中心碳在双酚 C 中成为 sp2 碳，导致分子刚性增强；而双酚 E 和双酚 F 中心 C 周围的空间位阻和疏水性均下降；双酚 B 和双酚 AF 中心 C 周围的空间位阻和 疏水性则相对增强。研究显示所有待测双酚类物质均可通过与正构位点作用而与 GPER 生成稳定复合物，范德华相互作用与分子间直接静电作用是结合的主要驱动力。与双酚 A 相比，双酚 B 和双酚 C 中心 C 原子取代基体积和结构刚性的增 强，一方面不利于污染物与受体间形成分子间氢键，同时也因相互作用残基数目 的减少而减弱不利于复合物稳定性的极性溶剂化效应，最终减弱了其与 GPER 的 亲和力。中心 C 原子取代基亲脂性的增加会增强范德华力和有利于复合物形成 的非极性溶剂化作用。所测试的 6 个结构高度相似的双酚类物质在与 GPER 结 合时均有 2 个相同的关键残基参与分子识别，即 TM3 上的 Leu137 和 TM6 上的 Trp272。而 Trp272 位于 TM6 上高度保守的 CWxP 序列中，是已知 GPCRs 活化 关键残基之一。而基于所获得的识别机制，可快速预测双酚 A 替代物与 GPER 的 亲和力及可能导致的毒性效应，而计算所获得的结合能与现有实验数据一致。

      4. 一个 GPER 拮抗剂双酚芴的发现及其分子机制解析

      双酚芴（Fluorene-9-bisphenol 或 9,9-bis(4-hydroxyphenyl)fluorene, BHPF）是 一种新型污染物，但目前其对 GPER 的影响还未见报道。本研究通过理论计算与 体外实验相结合的方式，发现并证实 BHPF 能与 GPER 直接作用而引发受体拮 抗效应。分子动力学模拟预测 Trp272 及 Glu275 是决定 GPER 与 BHPF 分子识别 和相互作用的两个关键残基，BHPF 无法激活 GPER 和打开水通道，表现为疑似 GPER 拮抗剂；并通过基因敲除、定点突变等证实了关键残基的作用。进一步的 体外测试表明 BHPF 与 GPER 选择性拮抗剂 G15 相似，均能抑制 G1 激活 GPER 所致胞内自由钙离子浓度的增加。不仅如此，BHPF 对 SH-SY5Y 细胞更强的毒 性提示其可能是比 G15 更强的 GPER 拮抗剂。此外，BHPF 和 G15 暴露都会影 响 GPER 信使 RNA 水平。综上所述，本论文提出 BHPF 是 GPER 的拮抗剂，并 阐明了其 GPER 识别作用的分子机制，对科学评估 BHPF 健康风险有重要意义。