与典型的右手螺旋 B-DNA 不同，Z-DNA 是左手螺旋结构，其磷酸骨架是连 续变化的 anti/syn 构象，形成 ZigZag 形状而被命名为 Z-DNA。Z-DNA 中磷酸骨 架相较 B-DNA 排列更紧密、排斥力更大，Z-DNA 的高能过渡态使细胞中 Z-DNA 的检测成为主要困难。钌多吡啶络合物[Ru(L)2(dppz)]2+（dppz,多吡啶[3,2-a:2',3'- c]并吩嗪）作为 DNA 的分子“光开关”，广泛用于探测 DNA 结构、细胞成像、 诊断治疗等多方面研究。但钌多吡啶络合物的低亲脂性使得先前的研究主要集中 在溶液体系，我们课题组最近的研究解决了这一局限，发现单独无法进入细胞核 的钌多吡啶络合物可与三类结构不同的化学物质（多氯酚、羰基氰化学物、非甾 体类抗炎药物）形成离子对并以被动扩散机理进入到细胞核。已有文章表明在溶 液体系中，某些钌多吡啶络合物可引起 DNA 的 B-Z 构象转变。既然我们发展的 离子对方法可将钌多吡啶络合物送入到细胞核，于是我们就提出了大胆的推测： 钌盐进入细胞核后有可能会引起基因组 DNA 的 B-Z 构象转变。因此本论文主要 是关于钌多吡啶络合物可逆调控活细胞内 DNA B-Z 构象转变的机理研究，主要 包括以下部分：钌多吡啶络合物可逆调控活细胞内 DNA 构象转变，钌多吡啶络 合物对映异构体可手性调控活细胞内 DNA 构象转变，手性钌多吡啶络合物可选 择性进入细胞核及光毒性机理研究。

       DNA“光开关”钌多吡啶络合物可逆调控活细胞 DNA B-Z 构象转化机理研究

      我 们 用 多 种 方 法 证 明 2,3,4,5-TeCP （ 2,3,4,5- 四 氯 苯 酚 ） 可 以 与 [Ru(phen)2(dppz)]2+（phen, 1,10-邻菲洛林）形成离子对并促进[Ru(phen)2(dppz)]2+ 进入细胞核。采用 Z-DNA 特异性抗体进行免疫荧光检测，我们发现进入细胞核 的[Ru(phen)2(dppz)]2+会引起细胞内DNAB-Z 构象的可逆转变形成稳定的Z-DNA， 并且发现 Z-DNA 的强度与细胞核中[Ru(phen)2(dppz)]2+的量有很好的相关性。Z DNA 结合蛋白 ZBP1 的表达升高也再次验证了细胞内 Z-DNA 的存在。但是溶液 体系的结果表明[Ru(phen)2(dppz)]2+与 DNA 结合虽然可产生类似 Z-DNA 的圆二 色谱（CD）信号，但该信号实际上来自于其手性对映异构体辅助配体（phen）间 激子耦合的改变，而非 DNA 构象变化。虽然 Ru(phen)2(dppz)]2+不能引起 DNA 的 B-Z 构象转变，但是它可选择性地与已经形成/存在的 Z-DNA 结合。我们的 CD 研究结果表明先前有关钌多吡啶络合物引起 DNA 构象转变的文章可能存在 解释错误。通过综合比较其他小分子 DNA 嵌合剂如 CBL0137（3,6-二乙酰基-9- [2-(异丙基乙基)]-9 氢-咔唑），DRAQ5（1,5-双{[2-（二甲基氨基）乙基]氨基} -4,8- 二羟基蒽-9,10-二酮）及 daunorubicin（柔红霉素），我们提出[Ru(phen)2(dppz)]2+ 诱导活细胞 Z-DNA 产生的可能机理：[Ru(phen)2(dppz)]2+嵌入 DNA 导致缠绕在 核小体上的 DNA 刚性增加或者直接干扰了组蛋白与 DNA 之间的相互作用，导 致 H1 组蛋白解离，核小体解聚，从而产生负超螺旋，又因[Ru(phen)2(dppz)]2+可 同时抑制拓扑异构酶对负超螺旋的解螺旋作用，最终积累足够的负超螺旋导致Z DNA 的产生，与此同时[Ru(phen)2(dppz)]2+可选择性地与已形成的 Z-DNA 结合， 且可能会因减少磷酸基团之间的排斥作用而稳定 Z-DNA。这是第一篇报道通过 配对/解配对离子对，DNA“光开关”化合物也可以作为活细胞内 DNA“构象开 关”的报道，这将为可逆调控 DNA 构象、理解 Z-DNA 及其结合蛋白的生物作 用开辟一条新的路线。

      两种钌多吡啶络合物对映异构体手性调控活细胞内 DNA B-Z 构象转变

       光学活性金属络合物的对映异构体在生物活性方面通常有明显的区别，而先 前的研究表明具有螺旋桨型手性结构的钌盐对映异构体与 B-DNA、Z-DNA 的结 合力存在显著区别，但并未见其引起 DNA 构象转变方面的研究。而我们用 Z DNA 抗体蛋白进行免疫荧光检测，发现 D-[Ru(phen)2(dppz)]2+在细胞内导致 Z DNA 的产生强度要大于 L-[Ru(phen)2(dppz)]2+。为了探讨产生这种区别的原因， 我们首先研究了[Ru(phen)2(dppz)]2+对映异构体在溶液体系中的区别，发现 D Ru(phen)2(dppz)]2+与 DNA 结合的荧光强度、荧光寿命、结合力都要强于 L- [Ru(phen)2(dppz)]2+；虽然两者与 BSA(牛血清白蛋白)的结合都很弱，但是 L- [Ru(phen)2(dppz)]2+ 与 BSA 结 合 的 荧 光 强 度 、 结 合 力 要 轻 微 的 强 于 D- [Ru(phen)2(dppz)]2+。与 rac-[Ru(phen)2(dppz)]2+相同，两个手性异构体在溶液体系 中与 B-DNA 或 Z-DNA 相互作用时只改变辅助配体（phen）间的激子耦合，而 不能引起 B-DNA 与 Z-DNA 之间的构象转变。之后在细胞体系的差异研究中发 现，2,3,4,5-TeCP 促进 D-/L-[Ru(phen)2(dppz)]2+进入细胞核的量基本相同，而 D- [Ru(phen)2(dppz)]2+在细胞核里引起 H1 组蛋白的解离程度、核小体的解聚程度都 要强于 L-[Ru(phen)2(dppz)]2+；在体外溶液中检测对拓扑异构酶的抑制效果 L- [Ru(phen)2(dppz)]2+则要更好。同时因 D-[Ru(phen)2(dppz)]2+与 DNA 的结合力(8.2±0.8*106M-1 )要大于 L-[Ru(phen)2(dppz)]2+ 与 DNA 的结合力 (3.3±0.4*106M 1 )，结合更紧密，它的正电荷可能对于已经形成的 Z-DNA 起到更好的稳定作用。 这些原因综合导致 D-[Ru(phen)2(dppz)]2+在细胞内诱导 Z-DNA 的产生强度更大。

       手性钌多吡啶络合物选择性进入细胞核及光毒性机理研究

      先前研究发现[Ru(DIP)2(dppz)]2+ (DIP = 4,7-二苯基-1,10-菲罗啉)本身只能分 布在细胞胞浆，而我们的研究发现 3,5-DCP（3,5-二氯苯酚）及 FFA（氟芬那酸） 可以促 进 [Ru(DIP)2(dppz)]2+ 进 入 细 胞 核 。 溶 液 体 系 中 结 果 表 明 D- [Ru(DIP)2(dppz)]2+与 DNA 结合的荧光强度、荧光寿命、结合力都要强于 L- [Ru(phen)2(dppz)]2+；而 L-[Ru(DIP)2(dppz)]2+与 BSA 结合的荧光强度、结合力要 强 于 D-[Ru(phen)2(dppz)]2+ 。 细 胞 体 系 结 果 表 明 在 3,5-DCP 促进手性 [Ru(DIP)2(dppz)]2+ 进入细胞核的过程中，D-[Ru(DIP)2(dppz)]2+主要分布在细胞核， 而 L-[Ru(DIP)2(dppz)]2+主要分布在细胞浆。我们之前的研究表明结合力及亲脂性 是影响钌多吡啶络合物进入细胞核的主要原因，因此我们对此进行了系统研究。 D-[Ru(DIP)2(dppz)]2+与BSA的结合力为4.74*105M-1，与3,5-DCP的结合力略大， 为 5.5*105M-1，而与 DNA 的结合力最大，为 18.55*106M-1。因此 3,5-DCP 的加 入不但可与细胞浆中的蛋白形成良好的竞争作用，使 D-[Ru(DIP)2(dppz)]2+从蛋白 上被竞争下来，同时与 DNA 的强结合力也会促进 D-[Ru(DIP)2(dppz)]2+在胞浆及 细胞核分布的平衡向细胞核移动去与基因 DNA 结合。L-[Ru(DIP)2(dppz)]2+与 BSA 的结合力为 6.4*105M-1，高于与 3,5-DCP 的结合力 5.5*105M-1，而与 DNA 的结合力为 8.7*106M-1。因此 3,5-DCP 的加入不能与细胞浆中的蛋白形成良好的 竞争作用，导致 L-[Ru(DIP)2(dppz)]2+主要分布在胞浆。进一步的研究发现 rac- [Ru(DIP)2(dppz)]2+/3,5-DCP 在 光 照 条 件 下 会 产 生 光 毒 性 效 应 ， 而 D- [Ru(DIP)2(dppz)]2+的光毒性效应要大于 L-[Ru(DIP)2(dppz)]2+。