同源重组是一种十分保守的生物学机制，主要参与 DNA 双链断裂的精确修 复和减数分裂过程中的非等位基因重组，在维持基因组稳定性和促进遗传多样性 等方面发挥着关键作用。RecA/Rad51 家族蛋白介导的 DNA 链交换反应是同源 重组通路的核心步骤。传统观点认为同源重组酶的直接接触是供体链分离的必要 条件。然而，新近研究发现 RecA 蛋白在生理 ATP 浓度条件下分散组装在入侵链 上，形成不饱和的核蛋白纤维丝结构，含有大量裸露的核苷酸位点。这一结构对 传统的 DNA 链交换模型提出了挑战，RecA 蛋白介导的 DNA 链交换反应可能存 在新的分子机制。针对这一科学问题，本文通过发展高灵敏的分析方法开展了相 关研究，主要包括以下三个方面的内容：

       （1）发展了一种稳定结合辅助的亲和毛细管电泳分析方法，可以对 RecA 介 导的 DNA 链交换反应进行快速、高灵敏分析。通过动力学毛细管电泳表征单链 DNA 结合蛋白（SSB）与单链 DNA（ssDNA）的相互作用，发现 SSB 对较长的 ssDNA（> 30 nt）具有更强的结合亲和力（Ka > 9.3 107 M−1），并且生成的复合 物非常稳定（koff < 0.004 s−1）。在此基础上，发展了一种稳定结合辅助的亲和毛细 管电泳分析方法，只需将少量的 SSB 添加到样品溶液中，通过一次进样即可实 现单双链 DNA 的快速（< 4.0 min）、高效（Rs > 16）分析。我们进一步证明了 SSB 稳定结合辅助的毛细管电泳方法可以用于较复杂的 DNA 链交换反应的快速、 高灵敏分析。

      （2）提出了一种双色交替激发（TCAE）的单分子荧光成像策略，并将其成 功应用于 DNA 链交换反应过程的实时观测和实验结果的定量分析。通过将荧光 基团 Cy3 和 Cy5 分别标记在供体双链 DNA（dsDNA）的两条链上，利用 TCAE 策略不仅可以清晰地判断链交换过程中分子事件的类型，还可以对链交换的实验 结果进行表征，验证了 ATP 水解可以促进链交换产物的释放。

      （3）揭示了不饱和组装核蛋白纤维丝介导 DNA 链交换反应的分子机制。利 用上述发展的 SSB 稳定结合辅助的毛细管电泳技术和 TCAE 单分子荧光成像技 术考察了 RecA 介导的链交换反应。通过截短入侵链或延长供体 dsDNA，本文发 现了核蛋白纤维丝的侧翼链分离活性。通过将不能结合 RecA 蛋白但具有碱基配 对能力的短的寡核苷酸链串联至截短的入侵链上，发现不依赖 RecA 蛋白的碱基 配对作用可以加速并促进供体 dsDNA 的侧翼链分离。基于上述结果，本文提出 了一种新颖的、基于侧翼链分离活性的链交换模型。在这种新的模型中，不饱和 组装的核蛋白纤维丝首先利用 RecA 结合的区域进行同源寻找并入侵供体 dsDNA 形成三链联会体。与此同时，由于侧翼链分离活性，联会体两侧的供体片 段发生解旋，释放出互补链与未被 RecA 结合的入侵链区域发生碱基配对。这种 不依赖 RecA 蛋白的碱基配对作用可进一步促进供体 dsDNA 更外侧片段的链分 离，从而确保整个区域链交换反应的完成。