紫外辐射（UV）诱导 DNA 相邻两个嘧啶碱基共价交联形成 DNA 嘧啶二聚体损伤， 其中产率最高的两类损伤是环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和 6-4 光产物（6-4PPs）。DNA 嘧 啶二聚体是 UV 遗传毒性的生物标志物，作为诱发皮肤癌的关键因素干扰 DNA 的复制和 转录，进而导致细胞死亡、衰老和突变。因此，准确测定 DNA 嘧啶二聚体损伤的全基因 组水平和分布是研究紫外辐射遗传毒性效应的关键内容。

      DNA 嘧啶二聚体损伤研究离不开先进的检测技术和方法。高效液相色谱-串联质谱 （HPLC-MS/MS）以其灵敏度高、准确性好的优势，在 DNA 损伤和 DNA 表观遗传修饰分 析领域应用广泛。DNA 测序技术是现代生命科学的核心技术之一，以高通量著称第二代测 序为各类 DNA 损伤的全基因组序列分析提供重要的检测手段。

      虽然 HPLC-MS/MS 已经应用于 DNA 嘧啶二聚体损伤分析，但是，由于嘧啶二聚体的 单体二核苷单磷酸含有带负电的磷酸基团，即使通过核酸酶和磷酸酶介导的基因组 DNA 酶切也无法去除，因此只能采用灵敏度低的负离子模式进行检测。为克服嘧啶二聚体质谱 检测灵敏度低的缺陷，本工作旨在建立一种高灵敏 UHPLC-MS/MS 方法，用于典型 DNA 嘧啶二聚损伤 T-T CPD 和 6-4PP 的准确测定。研究发现，与 LC-MS 负离子检测常用的铵 盐类（甲酸铵、碳酸氢铵和乙酸-三乙胺）添加剂相比甲酸显著增强 CPD 和 6-4PP 的离子 化效率，将质谱响应提高了 3.5 - 5.6 倍。此外，当甲酸浓度从常规的 0.1%（1000 ppm，v/v） 降至极低的 0.0001%（1.0 ppm，v/v）时，质谱信号进一步增加了约 5 倍。通过对分离条件 的考察和优化消除了 DNA 酶解液中脱氧腺苷（dA）、脱氧胞苷（dC）、脱氧鸟苷（dG）、 脱氧胸苷（dT）和 5-甲基脱氧胞苷（5mC）五种高丰度核苷潜在的基质效应对 CPD 和 6-4PP 离子化的抑制，提高质谱检测的准确性和重现性。本研究首次证明了甲酸对负离子模式 LC-MS 信号的增强效应，方法对 CPD 和 6-4PP 的检测限分别低至 20 和 80 amol，与已报 到的方法相比灵敏度提高 25 倍以上。利用 ppm 级甲酸增强的高灵敏 UHPLC-MS/MS 方法， 我们实现了低剂量 UVC（2.0 J/m2，采用高灵敏免疫分析能够检测到的最低剂量）辐射的 小鼠胚胎干细胞中 CPD 和 6-4PP 的准确定量。该方法有望应用于各类含有磷酸基团的 DNA 二聚体损伤和 DNA 修饰的高灵敏分析。

      为了提高二代测序的准确性和基因组覆盖率，本研究将多重免疫沉淀（MrIP）技术与 高灵敏损伤测序（HS-damage-seq）相结合，对 6-4PPs 进行单碱基分辨的全基因组测序。 使用两种 6-4PPs 抗体包括商品化的 64M-2 抗体和进化的 9c3 抗体互补性的捕获和富集含 有 6-4PPs 损伤的靶向 DNA 片段，并采用 ppm 级甲酸增强 UHPLC-MS/MS 方法评价 6-4PPs 多重免疫沉淀的富集效率。当 6-4PP 的初始水平为 2.15 个/106 dC 时，经过三轮免疫沉淀后 6-4PP 的丰度提高到 1.67 个/103 dC，富集倍数超过 750 倍。多重免疫沉淀极大限度的去除 了不含 6-4PPs 损伤的非目标 DNA 片段对测序的干扰，集中了 6-4PPs 序列信息。我们对 UVC 辐射的小鼠胚胎干细胞基因组 DNA 进行 6-4PPs 测序分析，利用两种抗体共检测到 5337660 个损伤位点，与单独使用任意一种抗体相比获得损伤位点的数量增加近一倍。由 于在常规聚合酶催化下 6-4PPs 阻碍 DNA 链延伸，导致 DNA 合成在 6-4PPs 损伤位点前发 生终止，基于 6-4PPs 这一生物学特性，通过选择性捕获引物延伸时被阻断的 DNA 片段本 工作发展了一种末端标记的 6-4PPs 文库构建新方法，对 6-4PPs 损伤位点的识别达到单碱 基分辨率。该测序方法可用于紫外辐射诱导的 DNA 嘧啶二聚体损伤形成、基因分布、修 复和信号传导的研究。