畜禽养殖生产中大量使用抗生素，导致畜禽粪便含有抗生素残留和携带抗生 素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的耐药菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB），成为抗生素抗性在环境中传播的重要载体。堆肥通过微生物活 动实现有机物腐殖化并产生有机肥，是畜禽粪便处理的无害化过程和回归农用的 资源化过程，也是阻控畜禽粪便抗生素抗性向环境和食物链传播的重要环节。本 文首先对市售有机肥中 ARGs 的丰度及分布特征进行调研，再通过实验室模拟控 制实验，开展辅料、高温期调控和复合微生物菌剂对猪粪堆肥中 ARGs 行为影响 的研究，以明确猪粪堆肥中 ARGs 的动态变化规律及其影响因素，提出可行的 ARGs 去除控制策略。取得以下主要结论：

    （1）有机肥中普遍存在四环素类抗性基因（Tetracyline resistance genes，TRGs） 和磺胺类抗性基因（Sulfonamide resistance genes，SRGs），且样品间总 ARGs 丰 度差异显著，绝对和相对丰度分别为 5.90 × 108 – 3.23 × 1012 copies g–1 DW 和 5.92 × 10–3 – 9.41 × 100。其中，工厂化生产有机肥的总 ARGs 丰度低于农户小规模生 产有机肥，新兴的蚯蚓堆肥、复合微生物肥总 ARGs 丰度普遍低于传统畜禽粪便 堆肥，该结果反映了过程控制和技术开发对控制堆肥中 ARGs 的必要性。有机肥 中 ARGs 的分布特征受畜禽粪便原料及堆肥过程的影响，充分腐熟和未腐熟的猪 粪肥中 ARGs 分布特征差异显著，复合微生物肥中的 ARGs 分布与添加的微生物 基因型有关。此外，整合子 intI1 和 intI2 与多种 TRGs 和 SRGs 正相关，表明其 参与了相关 ARGs 的水平转移（Horizontal gene transfer，HGT）过程。

    （2）辅料用于调节堆肥原料的 C/N 和改善孔隙结构，但其对堆肥过程中 ARGs 行为的影响鲜有研究。该部分研究使用小麦秸秆、玉米秸秆、杨木木屑和 蘑菇渣等 4 种国内典型的农业废弃物作为猪粪堆肥的辅料，发现堆肥结束时总 ARGs 绝对和相对丰度分别增高 0.43‒2.73 log 值和 0.19‒1.61 log 值。猪粪堆肥过 程中 ARGs、可移动基因元件（Mobile genetic elements，MGEs）分布的变化和 微生物群落的演替过程明显分为升温-高温和降温-腐熟两阶段，且辅料种类对该 过程影响不显著。此外，综合腐熟效果，选择小麦秸秆作为后续实验的辅料。

    （3）堆温是堆肥过程的重要控制指标，并且前期研究表明堆肥过程中 ARGs 分布变化按堆温变化分为两个阶段，因此采用提高高温期温度和延长高温期时长 等措施，研究高温期调控对堆肥中 ARGs 行为的影响。结果发现，堆肥结束时总 ARGs 绝对丰度增高 0.71–0.99 log 值，相对丰度降低 49.7–66.2%。与常规堆肥过 程相比，提高高温期温度和延长高温期时长未能改善总 ARGs 的控制。高温期调 控的堆肥过程中，ARGs、MGEs 分布的变化和微生物群落的演替与堆料有机质 含量（Organic content，OC）的变化显著相关：当堆料 OC 大于 82%时 ARGs、 MGEs 分布和微生物群落呈现堆肥前期特征，当 OC 小于 80%时两者呈现堆肥后 期特征，有机质等营养元素通过影响微生物群落（如 ARGs 宿主）进而影响 ARGs 的分布。

    （4）微生物群落是堆肥中 ARGs 的重要影响因素，并且前期研究表明 ARGs 分布与微生物群落在堆肥中均呈两阶段变化趋势，因此使用复合微生物菌剂影响 猪粪堆肥中 ARGs 的变化。结果表明，添加菌剂组的总 ARGs 绝对和相对丰度分 别降低 29.3–77.2%和 27.3–64.5%，普遍优于不添加菌剂组。高剂量添加和过渡 期二次添加菌剂可有效促进总 ARGs 的去除，是控制猪粪堆肥中 ARGs 的可行策 略。堆肥过程中 ARGs、MGEs 分布的变化和微生物群落的演替仍呈现升温-高温 和降温-腐熟两阶段特征，但菌剂的加入加快了该过程。添加菌剂组于第 14 天进 入降温-腐熟阶段，早于对照组的第 18 天。复合微生物菌剂可能改变 ARGs 与影 响因素的关系（如 ARGs 宿主、关联 MGEs 等）进而影响总 ARGs 的去除效果。

    （5）总体说来，堆肥过程中不同种类 ARGs 的动态变化规律呈现多样性： tetM、tetO、tetQ、tetW、ermA、ermB、fexA、fexB、blaTEM 和 mcr-1 在各实验 组中均显著减少，tetA、tetX、sulI、sulII、floR 和 aadA 在各实验组中均显著增 多；从 ARGs 大类来看，由 sulI、sulII 主导的磺胺和甲氧苄啶类抗性基因 （Sulfonamide and trimethoprim resistance genes，STRGs）和 aadA 主导的氨基糖 苷类抗性基因（Aminoglycoside resistance genes，AmRGs）难以通过猪粪堆肥去 除。MGEs 经历了堆肥前期转座子 Tn916/1545 占主导向堆肥后期 intI1 占主导的 变化过程。微生物群落经历了由堆肥前期 Firmicutes 为唯一优势菌门向堆肥后期 Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes 等菌门显著增多、多样性显著增强 的演替过程。

    （6）堆肥过程中存在较活跃的 ARGs 的 HGT 过程、多样化的 ARGs 宿主种 类及广泛的多重耐药菌，而堆料理化性质对 ARGs 的影响相对较弱。值得注意的 是：整合子 intI1 介导的 HGT 过程增强，且与数种增多的 ARGs 正相关；多数潜 在病原微生物得到有效去除，但 Mycobacterium、Bordetell 和 Bacillus 等病原微 生物与增多的 ARGs 正相关；整合子 intI1 和这些潜在病原微生物可能提高猪粪 堆肥中抗生素抗性传播的风险。