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蛤类育苗过程幼体规模性死亡细菌性病原分析

文献类型：学位论文

作者隋炜金
答辩日期2023-05-09
文献子类硕士
授予单位中国科学院大学
授予地点中国科学院海洋研究所
导师刘保忠
关键词文蛤 菲律宾蛤仔 16S rDNA 克隆文库 扩增子测序 弧菌
学位名称生物与医药硕士
英文摘要

文蛤（Meretrix petechialis）和菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）是我国重要的海产经济养殖蛤类。庞大的市场需求使得蛤类养殖业对苗种的需求不断增加，然而近年来蛤类在幼体培育期时常发生爆发性死亡事件，导致苗种数量供应不稳定，这制约了蛤类养殖业发展的同时也给育苗企业带来巨大的经济损失。本研究通过对文蛤、菲律宾蛤仔不同发育时期、不同健康状态下幼体微生物菌落特征比较分析，发现导致蛤类幼体大量死亡的潜在致病菌。进一步对致病菌进行分离纯化，从人工攻毒实验、侵染定殖幼体过程可视化、致病菌胞外产物（extracellular products，ECP）活性分析及益生菌应用等方面初步探讨了弧菌对幼体的致病机制和病害防控策略。主要结果如下：
1、通过构建 16S rDNA 克隆文库法对发病的文蛤幼体以及正常的稚贝与亲贝组织体内的微生物菌落特征进行了分析。共鉴定到了变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidia）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）等 13 个门、21 个纲、88 个属、142 个已知种的 474 株细菌。多样性指数分析表明文蛤浮游期壳顶幼虫发病样品微生物群落结构单一，各项多样性指数均低于其他几个时期的样品。发现地中海弧菌（Vibrio mediterranei）是发病的壳顶期幼虫样品中的优势菌，而健康稚贝和亲贝血细胞样品无明显优势菌，结果初步揭示了菌群组成与幼体健康状态的相关性，为我们进一步探索文蛤幼体规模化死亡原因提供线索。
2、进一步从文蛤发病幼虫中分离纯化得到地中海弧菌，人工感染实验证明其具有较强的致病性。利用荧光素标记方法，实现了地中海弧菌侵染幼虫的可视化。观察发现侵染过程可分 3 个阶段，分别是定殖阶段（0-12 h）、快速扩散阶段（12-24 h）和大量死亡阶段（24 h 后）。在地中海弧菌定殖阶段，感染幼虫的消化系统聚集了大量病原菌，但其外观各方面与健康幼虫一致，没有表现出任何症状。但当幼虫表现出游泳异常行为时，地中海弧菌已扩散至全身并破坏了幼虫的组织和器官，使得幼虫弧菌病表现出了突发性和难防控的表象。上述结果揭示了弧菌对幼虫的感染过程，可以帮助我们更好地了解其致病机制，为预防弧菌病害和提高育苗成功率提供帮助。
3、采用 16S rRNA 扩增子测序，对繁育场环境水样、菲律宾蛤仔亲贝性腺、受精卵以及处于不同健康状态的面盘幼虫微生物群落组成和多样性进行了分析，发现幼虫各个时期的微生物群落组成存在差异。结果显示在亲贝、受精卵和各个发育阶段的幼虫中存在核心微生物群落，多数分布在变形菌门、拟杆菌门中，它们可能在幼虫的生存和发育过程中发挥重要作用。分析发现菲律宾蛤仔幼虫发病前与发病后样品的多样性指数无显著差异，但微生物类群发生了改变。交替单胞菌科（Alteromonadaceae）、假交替单胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）、红杆菌科（Rhodobacteraceae）和黄杆菌科（Flavobacteriaceae）等可以作为指示幼虫健康水平差异的标志性微生物类群。
4、从菲律宾蛤仔幼虫发病样品中分离出 4 株灿烂弧菌（V. splendidus），对菲律宾蛤仔面盘幼虫进行人工侵染实验，结果表明分离到的 4 株灿烂弧菌不能引起幼虫大量死亡，但 4 株灿烂弧菌之间的致病力呈现出一定的差异。进一步对4株灿烂弧菌胞外产物的毒力以及胞外酶活性进行了检测。实验证明，ECP 的毒力与浓度呈正相关关系，且 ECP 的毒力差异与菌株致病性差异具有一致性。不同菌株间的部分胞外酶活性存在显著差异，其中 Vs-6 与 Vs-14 菌株相比胃蛋白酶和碱性磷酸酶活性呈现出相反的趋势。ECP 酶活与菌株毒力的关系还需要进一步探讨。
本研究通过构建16S rDNA 克隆文库和扩增子测序对不同发育阶段及发病的文蛤和菲律宾蛤仔幼体的微生物菌落进行了分析，研究结果揭示了蛤类幼体的微生物群落与发育、健康状态的关系。进一步对潜在病原菌进行了致病性检验和侵染过程追踪，初步揭示了病原菌可能的致病途径，为蛤类苗种培育过程中的病害防控提供技术支撑。

语种中文
目次
第一章 引言.............................................................................................1
1.1 蛤类生物学特征...............................................................................................1
1.2 蛤类养殖现状...................................................................................................2
1.3 蛤类的生殖周期...............................................................................................3
1.4 蛤类等双壳贝类病害研究进展.......................................................................5
1.5 贝类微生物多样性的研究进展及方法...........................................................7
1.6 研究目的及意义...............................................................................................8
第二章 不同时期文蛤体内细菌类型分析.......................................... 10
2.1 研究背景.........................................................................................................10
2.2 材料方法.........................................................................................................11
2.2.1 幼体培育和样品收集.............................................................................. 11
2.2.2 细菌基因组 DNA 提取和 16S rDNA 扩增............................................ 11
2.2.3 克隆文库的构建...................................................................................... 12
2.2.4 DNA 序列分析.........................................................................................12
2.2.5 数据分析.................................................................................................. 12
2.3 结果.................................................................................................................13
2.3.1 16S rDNA 克隆文库的构建.................................................................... 13
2.3.2 不同时期文蛤样品的细菌多样性分析.................................................. 14
2.3.3 门分类水平不同时期文蛤样品细菌类型分析...................................... 14
2.3.4 纲分类水平不同时期文蛤样品细菌类型分析...................................... 16
2.3.5 属分类水平不同时期文蛤样品细菌类型分析...................................... 17
2.4 讨论.................................................................................................................18
第三章 文蛤壳顶幼虫病原菌的分离鉴定和侵染过程分析..............21
3.1 研究背景.........................................................................................................21
3.2 材料方法.........................................................................................................22
3.2.1 实验动物.................................................................................................. 22
3.2.2 壳顶幼虫细菌的分离培养及鉴定.......................................................... 22
3.2.3 人工侵染实验及形态观察...................................................................... 22
3.2.4 药敏试验.................................................................................................. 23
3.2.5 益生菌对地中海弧菌侵染的影响.......................................................... 24
3.3 结果.................................................................................................................24
3.3.1 地中海弧菌的分离和初步鉴定.............................................................. 24
3.3.2 地中海弧菌对文蛤浮游幼虫致病力分析.............................................. 25
3.3.3 地中海弧菌侵染文蛤幼虫过程显微观察.............................................. 26
3.3.4 地中海弧菌药敏特征.............................................................................. 27
3.3.5 益生菌对地中海弧菌感染的影响.......................................................... 30
3.4 讨论.................................................................................................................31
第四章 菲律宾蛤仔不同发育时期细菌类型分析.............................. 34
4.1 研究背景.........................................................................................................34
4.2 材料方法.........................................................................................................34
4.2.1 样品收集.................................................................................................. 35
4.2.2 DNA 提取和 PCR 扩增........................................................................... 34
4.2.3 文库构建和上机测序分析...................................................................... 34
4.2.4 信息分析.................................................................................................. 34
4.3 结果.................................................................................................................35
4.3.1 测序样品 ASV 和复杂度分析................................................................ 35
4.3.2 菲律宾蛤仔幼虫核心微生物群鉴定分析.............................................. 36
4.3.3 微生物群落结构分析.............................................................................. 39
4.3.4 微生物群落多样性分析.......................................................................... 40
4.3.5 不同健康状态菲律宾蛤仔样品中的指示类群...................................... 47
4.4 讨论.................................................................................................................48
第五章 菲律宾蛤仔幼虫病原菌的分离与鉴定.................................. 52
5.1 研究背景.........................................................................................................52
5.2 材料方法.........................................................................................................53
5.2.1 实验动物.................................................................................................. 53
5.2.2 灿烂弧菌分离与培养.............................................................................. 53
5.2.3 人工侵染实验.......................................................................................... 53
5.2.4 益生菌对灿烂弧菌毒力的影响.............................................................. 54
5.2.5 胞外产物攻毒实验（ECP）................................................................... 54
5.3 结果.................................................................................................................54
5.3.1 灿烂弧菌的分离纯化.............................................................................. 54
5.3.2 灿烂弧菌对菲律宾蛤仔幼虫致病力分析.............................................. 55
5.3.3 胞外产物攻毒实验及毒力相关活性物质检测...................................... 56
5.3.4 益生菌对灿烂弧菌感染的影响.............................................................. 58
5.4 讨论.................................................................................................................59
结论........................................................................................................... 61
参考文献...................................................................................................63
致谢............................................................................................................74
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果...................... 75
源URL[http://ir.qdio.ac.cn/handle/337002/181129]  
专题海洋研究所_实验海洋生物学重点实验室
推荐引用方式
GB/T 7714		 隋炜金. 蛤类育苗过程幼体规模性死亡细菌性病原分析[D]. 中国科学院海洋研究所. 中国科学院大学. 2023.

入库方式： OAI收割

来源：海洋研究所

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