摘  要

海洋微生物广泛分布于各种海洋生境中，拥有十分庞大的生物量，贡献了近一半的全球初级生产力，并在生物地球化学循环中起到重要作用。海洋微生物以其丰富多样的代谢机制参与和调控着海洋中碳（C）、氮（N）、硫（S）等重要营养元素的循环。因此，研究海洋微生物多样性及代谢机制在阐明生物地球化学循环和微生物互作关系等方面具有重要意义。

1. 热带西太平洋硝酸盐还原细菌多样性及代谢分析

热带西太平洋是世界上最大的贫营养海域之一，其初级生产力低，是研究氮素限制下微生物代谢的理想区域。本研究从热带西太平洋海域透光层中采集到22个站位的154个不同水层深度的海水样品，采用选择性培养基和基于纯培养的方法，共分离获得了来自不同海水样品的634株硝酸盐利用细菌，隶属于4个门（变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门），5个纲（α-变形菌纲、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、Flavobacteriia和放线菌纲），54个属和94个种，绝大部分可培养硝酸盐利用细菌属于变形菌门（97.32%），其中，α-变形菌纲和γ-变形菌纲的菌株分别占总数的71.45%和25.87%。

我们对菌株的硝酸盐还原能力进行测定，获得了295株硝酸盐还原细菌，隶属于19个属29个种，占据了硝酸盐利用细菌总数的46.53%。选取其中29株不同种的硝酸盐还原细菌，结合表征特点及全基因组分析结果对其参与透光层的碳、氮、硫元素代谢进行分析。

通过基于氮循环途径的关键基因分析，我们发现29株细菌均含有同化硝酸盐还原（assimilatory nitrate reduction，ANR）、异化硝酸盐还原为铵（dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）或反硝化（denitrification）关键基因，具有将硝酸盐还原为亚硝酸盐的能力；其中团聚玫瑰色菌Roseibium aggregatum XTF-10、海运海杆菌Marinobacter nauticus XTF-138和对虾盐单胞菌Halomonas litopenaei XTF-114含有反硝化途径的关键基因（napAB/narGHI、nirS、norBC和nosZ）；19株细菌含有可以将硝酸盐还原为氨的DNRA途径基因（napAB/narGHI和nirBD/nrfA）或ANR途径基因（nasA/NR/narB和nirA）。在有机氮获得受限的情况下，硝酸盐还原细菌可以通过同化/异化硝酸盐还原途径合成氨继而进行胞内物质的合成和获得能量，该过程同时还耦合了其他营养元素的变化，因此，硝酸盐还原对海洋细菌而言是一个极其重要的代谢途径。

通过基于硫代谢途径的关键基因分析，29株硝酸盐还原细菌均含有同化硫酸盐还原（assimilatory sulfate reduction，ASR）途径相关基因；其中深海海旋菌Thalassospira profundimaris XTF-160、氧化锰太平洋杆状菌Pacificitalea manganoxidans XTF-281、海洋玫瑰色菌Roseibium marinum XTF-14、嗜碱海杆状菌Maritimibacter alkaliphilus XTF-27、印度洋斯塔普氏菌Stappia indica XTF-106和团聚玫瑰色菌 XTF-10含有硫氧化（sulfur oxidation，SOX）相关基因（soxA、soxB、soxC 、soxX、soxY和soxZ），通过表征实验发现，上述菌株均具有将硫代硫酸盐氧化为硫酸盐的能力。此外，我们还发现深海海旋菌XTF-160、运动特里顿杆菌Tritonibacter mobilis XTF-65、海洋玫瑰色菌XTF-14、团聚玫瑰色菌XTF-10和嗜碱海杆状菌XTF-27含有二甲基巯基丙酸内盐（DMSP）合成基因（dsyB或mmtN）；对虾盐单胞菌XTF-114、运动特里顿杆菌XTF-65、海洋玫瑰色菌XTF-14和团聚玫瑰色菌XTF-10含有DMSP裂解基因（dddD、dddP或dddL），具有介导DMSP裂解成二甲基硫化物（DMS）的能力；上述6株参与DMSP合成或裂解的不同硝酸盐还原细菌均位于Chl-a最大层附近，Chl-a最大层通常存在有大量的DMSP，因此这些硝酸盐还原细菌可能参与透光层中DMSP的合成和裂解。

通过对29株硝酸盐还原细菌有机碳代谢潜力进行分析，鉴定出5个CAZyme超家族的2197个基因，其中具有代表性的酶类包括糖基转移酶（GT）、糖苷水解酶（GH）、碳水化合物酯酶（CE）、辅助活性（AA）、多糖裂解酶（PL）和碳水化合物结合模块（CBMs）分别占比为40%、36%、5%、3.8%、1.7%和12.8%；还注释到了分属于20个家族的563个可能存在的分泌肽酶；其中金属、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸和天冬氨酸肽酶家族分别占60.8%、29.2%、5.7%、3.9%和3.6%。此外，还从基因组中预测了6类用于降解复杂多糖的酶，其中编码几丁质降解酶的相关基因数量最多，几丁质酶GH23家族丰度最高，其次是几丁质结合模块CBM5和几丁质酶GH18。多种基因编码降解有机碳相关的酶类可能协助硝酸盐还原细菌利用环境中的有机物作为碳和氮的重要来源，从而在寡营养条件下得以生存和繁殖。

2. 亚硝酸盐还原基因nirS对巴利阿里假单胞菌Pseudomonas balearica XTF-326硝酸盐代谢通路的影响

巴利阿里假单胞菌Pseudomonas balearica XTF-326分离自热带西太平洋海域透光层。根据全基因组注释分析，发现该菌株拥有完整的硝酸盐异化还原通路，包括反硝化和硝酸盐异化还原为铵（DNRA）两种途径。

巴利阿里假单胞菌XTF-326反硝化途径关键酶之一的亚硝酸盐还原酶为nirS编码的细胞色素cd₁型亚硝酸盐还原酶。我们利用同源重组的方法，得到nirS缺失的ΔnirS突变株用以研究nirS对菌株生长以及硝酸盐代谢通路的影响。实验结果表明：nirS的缺失对ΔnirS突变株的好氧生长影响较小，但会严重影响ΔnirS突变株的厌氧生长以及亚硝酸盐还原能力。在厌氧环境下，ΔnirS突变株会通过上调DNRA途径中的亚硝酸盐还原酶基因nirBD以及反硝化途径的一氧化氮还原酶基因norBC和一氧化二氮还原酶基因nosZ的表达，以及下调硝酸盐还原酶基因（napAB、narGHI）的表达以应对较高的亚硝酸盐浓度，但ΔnirS突变株仅利用DNRA途径无法将培养基中的亚硝酸盐完全还原。我们推测反硝化途径在亚硝酸盐代谢的过程中发挥主导作用；而DNRA途径起到的作用有限。

3. 一株火色杆菌科新属细菌的分类鉴定

菌株KN852^T从热带西太平洋卡罗琳海山中分离得到，为革兰氏阴性、金黄色、无芽孢形成、严格需氧、细长的杆状菌；主要呼吸醌为MK-7；主要极性脂质组分包含磷脂酰乙醇胺、1种未知的磷脂和6种未知的极性脂质；主要细胞脂肪酸是iso-C_15:0、summed feature 3（C_16:1ω7c 和/或 iso-C_15:0 2OH）、iso-C_17:0 3OH和iso-C_15:1 G。16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，菌株KN852^T属于拟杆菌门（Bacteroidota）、火色杆菌科（Flammeovirgaceae），并形成了一个独特的支系。该菌株的基因组DNA G+C含量为34.8 mol%。综合考虑其表型特征、化学特征和遗传学特征，认为菌株KN852^T代表了火色杆菌科的一个新属的新物种，命名为Marinigracilibium pacificum，模式菌株为KN852^T（=CGMCC 1.17119^T=KCTC 72433^T）。