当前，新冠肺炎疫情在全球范围内迅速蔓延，带来了前所未有的挑战。为了快速有效地控制疫情，接种疫苗仍是最有效的方法。多数新冠疫苗项目的研究热点集中在刺突蛋白上，但病毒变异株的出现已经威胁到了现有疫苗的有效性。因此，迫切需要开发出具有高免疫原性和特异性的新疫苗靶点，以便及时进行候选疫苗的开发。ORF8蛋白是由SARS-CoV-2基因组编码的辅助蛋白之一，它在病毒感染中发挥重要作用, 并且在识别病毒方面表现出高度的敏感性；每个ORF8蛋白含有4个B细胞抗原表位，可以抑制I型干扰素产生，下调MHC-I类分子抗原提呈，从而介导免疫逃逸。因此，抑制ORF8蛋白的功能可以大大降低疾病严重程度。基于以上原因，ORF8蛋白可以作为一种潜在的新冠疫苗抗原靶点。因为要研究单一抗原ORF8蛋白作为SARS-CoV-2疫苗抗原的可行性，并考虑到疫情期间需要大规模接种疫苗，重组蛋白疫苗廉价经济适合批量生产，所以本论文最终选择重组蛋白疫苗作为ORF8蛋白的疫苗类型。重组蛋白疫苗因其成分仅含单一有效抗原而安全性大幅提升，但相应地会导致疫苗免疫原性低、体内快速清除等问题，而且这类疫苗以诱导CD4+ T细胞活化和特异性中和抗体反应为主，对CD8+ T细胞的刺激较差，不能诱导T细胞免疫记忆和抗原类型的转换。因此，需要对抗原蛋白进行适当的修饰以提升其免疫原性、延长免疫作用时间，并加强免疫记忆作用，化学修饰是当前常用的方式之一。为增强ORF8蛋白的免疫原性，本论文设计了两种化学修饰的ORF8抗原：（1）ORF8-CRM197。CRM197是一种载体蛋白，它的优势是可以降低载体诱导的表位抑制效应，可诱发Th1型和Th2型细胞因子分泌，增强细胞免疫和体液免疫应答，有助于产生免疫记忆性，且容易生产，因此在商用疫苗中应用广泛。（2）ORF8-PEG。八臂聚乙二醇（8-arm PEG）是一种线性生物相容性聚合物，可将多个抗原分子偶联在一个实体上，降低抗原之间的空间屏蔽效应，增加抗原表位数；同时因为是共价结合，提高了疫苗稳定性；它还能延缓抗原的肾滤过，延长体循环和免疫系统暴露时间，这反过来又增加了疫苗被吞噬细胞捕获的可能性。论文的主要研究内容为：（1）ORF8蛋白的表达与分离纯化，开发了一种简单可靠的分离纯化方法，并获得高纯度的ORF8蛋白，以备后续研究使用。首先利用单因素实验，确定出ORF8蛋白诱导表达的最优条件为16 ℃、0.6 mM IPTG、16 h，最大限度地表达出多的蛋白；然后确定ORF8蛋白的表达途径是包涵体；最后改良了ORF8蛋白的复性纯化顺序及条件，与常规操作不同的是，我们先将蛋白的二级结构打开，在组氨酸标签外露时便通过亲和层析的方式纯化蛋白，纯化之后再进行复性的过程，得到了高纯度的ORF8蛋白。（2）通过化学修饰的方法，制备出经过载体蛋白CRM197和八臂聚乙二醇修饰的新型抗原，并对其免疫原性进行研究。研究发现，与ORF8-CRM197和ORF8/AL组相比，ORF8-PEG组诱导的ORF8特异性IgG滴度更高，IFN-g、TNF-a和IL-5水平更高，刺激脾细胞增殖能力更强。因此，修饰了八臂PEG的ORF8抗原能有效改善机体抗病毒免疫应答，此外，它对心脏、肝脏和肾功能没有明显的毒副作用。综上所述，通过对ORF8蛋白及其免疫原性的研究，结果显示ORF8-PEG有望作为一种SARS-CoV-2疫苗的新型抗原被开发。 关键词：新冠病毒，ORF8辅助蛋白，重组蛋白疫苗，载体蛋白，聚乙二醇