疫苗生产过程中有效的质量控制（quality control，QC）是提升疫苗质量和防控传染性疾病的重要保证。由于病毒抗原具有尺寸大（几十至上百纳米）、三维结构复杂、溶液浓度极低、生物学活性依赖于结构完整性等特点，长期以来其质量控制非常重要但仍具挑战。传统的疫苗质量控制方法，如动物体内实验及其他体外免疫学分析，成本高、耗时长、准确性低，难以满足质量控制的需求。本论文以灭活口蹄疫病毒（inactivated foot and mouth disease virus，iFMDV）疫苗为研究对象，设计并建立包括核酸酶预处理-高效尺寸排阻色谱（nuclease digestion - high performance size exclusion chromatography，ND-HPSEC）、毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）、差示扫描荧光（differential scanning fluorimetry，DSF）等多种质量控制新技术，对病毒疫苗进行质量控制和在线研究，实现产品质量和稳定性的提升。主要研究内容与结果如下：（1）建立了ND-HPSEC用于iFMDV商品疫苗中完整抗原146S的定量检测。系统研究了超速离心法、PEG沉淀法、离心色谱法和核酸酶消化法等四种预处理方法去除iFMDV商品疫苗中杂质的能力，其中核酸酶消化法处理效果最好，表现出处理速度快、准确性高、去除完全、操作简单等优势，表明核酸是最主要的干扰物质。通过响应面实验确定最优核酸酶处理条件为200 μL水相中添加终浓度421 U/mL的Benzonase，25.1oC反应1.29 h。在此基础上建立ND-HPSEC，并对来自4家企业的各3种不同血清型共计12批样品进行146S含量检测，结果表明ND-HPSEC具有较好的准确性和重复性（RSD<5.3%，n=3）。通过该方法能够有效解决商品疫苗抗原定量检测中杂质干扰的难题，保证检测结果的准确可靠，扩大了HPSEC检测技术的应用范围。（2）基于CZE建立了一种简单、快速的在线分离和定量iFMDV单价和双价疫苗中146S的方法。在优化的紫外检测波长、背景电解质、进样量和分离电压等检测条件下，A型和O型146S在15-400 μg/mL浓度范围内均表现出良好的重现性（RSD<5%）以及抗原含量对应峰面积的线性响应关系（R2=0.999）。随后利用不同血清型病毒粒子结构差异所导致的CZE迁移时间差异，实现了A/O双价146S的分离及定量，相对误差<10%。建立的CZE方法成功应用于O型单价和A/O双价iFMDV商品疫苗的定量检测。相较于HPSEC，CZE不仅能够对不同血清型146S定量，而且不受核酸杂质的干扰。（3）建立了在线分析佐剂中iFMDV热稳定性的DSF检测技术。以SYBR Green II为荧光探针，DSF最低可以检测浓度为5 µg/mL iFMDV的Tm值。与溶液中的iFMDV相比，在三种代表性的油包水、水包油及颗粒佐剂中iFMDV的热稳定性均略有降低，其中吸附在磷酸铝颗粒上的iFMDV Tm值降低最为显著。利用DSF筛选佐剂中疫苗的稳定剂型，发现蔗糖和甘油均能增加在三种佐剂中iFMDV的热稳定性，并结合HPSEC和差示扫描量热（DSC）证明了筛选结果的可靠性。DSF在低纯度iFMDV溶液、以及预先混合佐剂的成品疫苗检测中同样具有良好的适用性，且具有不受蛋白杂质干扰的优势。（4）采用HPSEC结合DSF，对iFMDV在溶液和最常用的水/油/水型ISA 206佐剂中的稳定制剂配方进行筛选。通过Box-Behnken响应面试验，确定含65 mM CaCl2和50 g/L蔗糖的200 mM HEPES溶液为A型和O型iFMDV的稳定剂型。该溶液条件下A型和O型146S Tm达到59.2oC和58.2oC，分别高于对照组近10oC和12oC。将iFMDV与ISA 206乳化配制的疫苗在37oC储存，A型稳定剂组储存50天后剩余抗原约35%，对照组仅余不足10%；对于稳定性更差的O型，稳定剂组储存40 h后几乎无裂解，而对照组完整抗原仅剩余7%。（5）通过HPSEC、DSF、圆二色光谱、荧光扩散等多种检测技术，结合动物实验，系统考察凝胶过滤色谱（size exclusion chromatography，SEC）过程对iFMDV结构及生物学活性的影响，并探索了抑制其结构变化的策略。发现iFMDV经过孔径相近或大于其颗粒直径的SEC介质后，尺寸及分子量无显著变化，但在HPSEC谱图上的保留时间前移，二级和三级结构发生一定改变，Tm降低；荧光扩散实验证明iFMDV病毒颗粒结构变得松散。而经过孔径小于iFMDV颗粒直径的SEC介质后则无上述明显结构变化。推测iFMDV在能够进入介质孔道的SEC过程中，与孔道内壁产生的物理碰撞导致其结构微观变化。小鼠免疫实验发现微观构像的变化和稳定性的降低，导致免疫初期抗体水平的降低，不利于动物接种疫苗后快速形成免疫保护。在流动相添加5 mM CaCl2可有效抑制SEC过程中146S结构的破坏。