毛细管电泳-激光诱导荧光偏振分析：单核苷水平核酸适配体-蛋白质相互作用研究
文献类型：学位论文
| 作者 | 章大鹏 |
| 学位类别 | 博士 |
| 答辩日期 | 2012-05 |
| 授予单位 | 中国科学院研究生院 |
| 授予地点 | 北京 |
| 导师 | 汪海林 |
| 关键词 | 核酸适配体 凝血酶 毛细管电泳 荧光各向异性 G-四链体 nucleic acid aptamer thrombin capillary electrophoresis fluorescence anisotropy G-quadruplex |
| 学位专业 | 环境科学 |
| 中文摘要 | 核酸适配体是一类具有一定长度的单链DNA或RNA分子，可特异性地识别各种靶分子（如有机小分子、多肽、蛋白质），乃至靶细胞。一般而言，核酸适配体可通过体外人工进化，从随机的寡核苷酸文库中筛选获得。近年来，这类新型的识别分子已在生化分析、疾病诊断、环境与健康等研究领域引起了广泛的关注。目前，已筛选出几百种核酸适配体，但是人们对核酸适配体如何识别靶分子这一关键科学问题尚不清楚。核酸适配体-靶分子相互作用的研究是阐明这一科学问题的关键，有助于实现对核酸适配体的合理设计、改造和修饰，可拓展其在生化分析、环境与健康等领域的实际应用。相关的分析新技术新方法的发展，可为其相互作用研究提供新的思路。为此，我们在核酸适配体与蛋白质相互作用研究和分析方法两方面开展了有益的探索。 本论文以人α-凝血酶及其核酸适配体作为研究对象，首先利用先进的毛细管电泳-激光诱导荧光偏振分析技术，发展了一种在单核苷水平上测定核酸适配体-蛋白质相互作用的分析方法；在此基础上，利用鉴定出的特定位置标记的核酸适配体，结合均相荧光偏振分析，发展出新颖的高选择性、高灵敏的核酸适配体传感检测方法，可应用于复杂基质中蛋白质的分析。同时，进一步探讨了标记的荧光基团与核酸适配体所含有的G-四链体结构的相互作用，发展出G-四链体构象分析的新方法。论文主要包括以下三个方面的创新性工作： 1. 首次提出利用荧光偏振在单核苷水平测定核酸适配体与蛋白质相互作用的新方法。首先，依据适配体TA29的序列，设计了9种在特定T碱基位置上选择性标记了单一荧光基团的适配体，利用毛细管电泳-激光诱导荧光偏振分析，研究了其与靶蛋白（凝血酶）的相互作用，不仅获得结合参数，而且同时获得各组分的荧光偏振数据。根据“小分子荧光标记与生物大分子的近距离作用可显著增强其荧光偏振响应”的机理，通过比较与靶蛋白结合前后特定T位置标记的核酸适配体荧光偏振响应的变化，可定性判断适配体中该T位置与凝血酶结合的距离远近。TA29核酸适配体中T7、T20、T25和3’标记的核酸适配体与靶蛋白结合后荧光偏振响应显著增加 (Δr >0.098 )，可鉴定为近距离结合位点，而5’、T3和C15T标记的核酸适配体与靶蛋白结合后荧光偏振响应的增幅较小或降低 (Δr <0.056 )，可鉴定为远距离结合位点。该方法具有快速、灵敏且毋需交联反应的优点。 2. 提出并建立了一种基于荧光偏振响应降低的核酸适配体传感分析新方法。在上述相互作用研究中，我们发现：一个特定位置标记的TA29与靶蛋白结合后荧光偏振响应降低。在此基础上，我们设计了三种核酸适配体(C15T-TMR-TA29、3’- TMR-TA29和5’- TMR-TA29)。其中，3’- TMR-TA29和5’- TMR-TA29与凝血酶荧结合后荧光偏振响应分别增加Δr = 0.039和Δr = 0.010，而C15T-TMR-TA29与凝血酶结合后荧光偏振响应显著降低(Δr= −0.081)。利用E. coli MutS与单链DNA的弱相互作用，我们进一步考察了两种探针对非特异性结合或弱相互作用的耐受能力，结果发现：在存在E. coli MutS的竞争情形下，C15T-TMR-TA29仍显示凝血酶依赖性的荧光偏振响应降低，而3’-TMR-TA29却不再呈现凝血酶依赖性的荧光偏振响应增加。在实际应用模拟中，我们发现，利用荧光偏振响应降低型C15T-TMR-TA29可检测出50倍稀释血清中加入的250 pM凝血酶；与之相比，传统的荧光偏振响应增加型3’-TMR-TA29对高浓度凝血酶（64 nM）仍无明显响应。这些结果一致表明，荧光偏振响应降低型的核酸适配体探针具有更高的选择性，可应用于基质复杂的生物样品分析。初步的研究表明，对于PDGF-BB蛋白，也可以筛选和鉴定出荧光偏振响应降低型核酸适配体。 3. 阐明了核酸适配体荧光偏振响应降低的分子基础，并进一步发展了可检测G-四链体的新方法。在上述工作中，我们发现的荧光偏振响应降低现象并不能简单地采用传统理论解释。我们设想：凝血酶结合诱导核酸适配体形成了G-四链体，消除了标记荧光基团与核酸适配体的分子内作用，从而引起响应降低。为此，设计了一种含有G-四链体结构域的寡核苷酸(TA15)，通过荧光偏振及荧光强度、圆二色谱分析和分子动力学模拟，证明了G-四链体形成可降低荧光偏振响应，并且与分子内作用改变相关。采用突变序列，我们进一步证实这种显著的荧光偏振响应降低具有高选择性。在此基础上，建立了核酸适配体的荧光偏振分析新方法，不仅可测定G-四链体结构与各种无机小分子的相互作用，而且可用于人端粒DNA（含丰富的G-四链体结构）的研究。 |
| 公开日期 | 2013-10-21 |
| 源URL | [http://ir.rcees.ac.cn/handle/311016/7159]  |
| 专题 | 生态环境研究中心_环境化学与生态毒理学国家重点实验室 |
| 推荐引用方式 GB/T 7714 | 章大鹏. 毛细管电泳-激光诱导荧光偏振分析：单核苷水平核酸适配体-蛋白质相互作用研究[D]. 北京. 中国科学院研究生院. 2012. |
入库方式： OAI收割
来源：生态环境研究中心
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