文蛤（Meretrix petechialis）是我国一种重要的滩涂养殖贝类，具有较高的经济和生态价值。随着市场需求与日俱增，文蛤养殖业得到了迅速发展。而在养殖过程中，尤其在夏季高温期，文蛤大规模死亡事件时有发生，导致了严重的经济损失，制约了贝类养殖业的可持续发展。夏季是文蛤的生殖季节，文蛤繁殖过程中会产生繁殖代价，且雌雄间的应对策略存在差异。因此，以生殖为切入点，研究文蛤在配子排放后恢复期的生理状态与能量代谢调控的性别差异，对于降低繁殖期死亡率、促进文蛤健康养殖具有重要意义。本研究分析了雌雄文蛤配子排放后及恢复期间的生理指标和糖代谢过程的差异，并选取了配子排放后的雌雄文蛤亲本进行了转录组测序，解析了配子排放后不同时间以及不同排放次数对文蛤能量代谢和生理状态的影响。主要研究结果如下：

1、采用静水法和次溴酸钠氧化法对生殖后雌雄文蛤生理指标进行了检测，发现生殖后雌蛤的耗氧率（R_OR ）、排氨率（R_NR）、摄食率（R_IR）及排粪率（R_FER）均高于雄蛤，表明雌蛤的生理活动强度高于雄蛤，并且繁殖代价更大，繁殖后需要摄入更多能量以恢复状态；雌雄文蛤的氧氮比在生殖后一直高于24，提示代谢底物以碳水化合物和脂肪为主。

2、运用酶活测定等方法，对雌雄文蛤生殖前后糖代谢指标进行了检测，发现生殖后雌、雄文蛤糖代谢强度存在一定程度的变化，雌蛤的能量消耗高于雄蛤。糖原磷酸化酶基因与葡萄糖转运蛋白基因在雌蛤中的相对表达量高于雄蛤，且表达模式与底物的变化趋势一致，均体现了生殖后文蛤足组织中葡萄糖含量先上升后下降的变化，同时糖原含量先下降后上升的变化表明其与葡萄糖存在相互转化；与雄蛤相比，雌蛤的PFK（磷酸果糖激酶，Phosphofructokinase）活性生殖后显著下降。生殖对糖代谢途径的关键酶活性造成了一定程度的抑制，且雌蛤受到的影响大于雄蛤。转录组数据表明生殖7 d后，雌、雄文蛤间的DEGs仅有22个，暗示经过7 d的恢复，雌、雄文蛤间的差异在逐渐减少。

3、通过配子集中催产和排放实验发现，文蛤经过第1次大规模排放配子7 d后，在存活文蛤亲本中，雄蛤中有73%的个体能够再次精子排放，而雌蛤仅有29%的个体实现第2次排卵，且文蛤第2次排放的配子数量显著降低。转录组数据分析发现，雌蛤中富集到了与抗氧化防御、物质代谢相关的信号通路，2次排放配子的雌蛤能量需求增大，糖代谢水平受到了抑制，免疫响应强度上升；在雄蛤中富集到了糖代谢、脂代谢以及氨基酸代谢，表明2次排放配子同样对雄蛤的能量需求和糖代谢产生了影响，糖代谢水平受到了抑制，但免疫防御受到的影响不大。

上述研究结果有助于理解生殖活动对不同性别文蛤能量代谢的影响及差异，可为文蛤健康养殖提供科学参考。

第1章 绪论  1

1.1 文蛤生物学与养殖概况 1

1.1.1 文蛤生物学  1

1.1.2 文蛤养殖现状与影响因素  1

1.2 文蛤的生殖    3

1.2.1 文蛤的生殖系统  3

1.2.2 文蛤的繁殖习性  4

1.2.3 文蛤的配子发生  5

1.3 生殖与代谢的权衡 6

1.3.1 海洋生物在生殖过程中的适应策略  6

1.3.2 海洋生物的生殖代价  7

1.3.3 贝类繁殖过程中的能量代谢     9

1.3.4 贝类繁殖过程中的糖代谢  9

1.3.5 贝类繁殖过程中的脂类与蛋白代谢  11

1.4 本研究的内容和意义    11

第2章 生殖过程对文蛤生理代谢的影响  13

2.1 材料与方法    13

2.1.1 实验动物     13

2.1.2 生理指标测定     14

2.1.3 数据分析     15

2.2 结果 15

2.2.1 生殖后雌、雄文蛤耗氧率、排氨率的变化     15

2.2.2 生殖后雌、雄文蛤氧氮比的变化     17

2.2.3 生殖后雌、雄文蛤摄食率、排粪率的变化     17

2.3 讨论 18

第3章 生殖过程对文蛤糖代谢的影响     21

3.1 材料与方法    21

3.1.1 文蛤催产与组织取样  21

3.1.2 糖原含量和葡萄糖含量检测     21

3.1.3 己糖激酶活性和磷酸果糖激酶活性检测  22

3.1.4 丙酮酸含量和乳酸脱氢酶活性检测  23

3.1.5 qPCR检测    24

3.1.6 生殖后雌雄文蛤转录组组织取样     25

3.1.7 生殖后7 d雌雄文蛤转录组组织取样      25

3.2 结果 25

3.2.1 糖原与葡萄糖含量在雌雄文蛤中生殖前后的变化分析  25

3.2.2 HK与PFK活性在雌雄文蛤中生殖前后的变化分析 26

3.2.3 PA含量在雌雄文蛤中生殖前后的变化分析     28

3.2.4 LDH活性在雌雄文蛤中生殖前后的变化分析  28

3.2.5 雌雄文蛤生殖前后糖代谢相关基因表达差异分析  29

3.2.6 生殖后雌雄文蛤转录组数据分析     31

3.2.7 生殖后7 d雌雄文蛤转录组数据分析      34

3.3 讨论 35

第4章 雌雄文蛤配子排放次数对性腺能量代谢影响的转录组分析     39

4.1 材料与方法    39

4.1.1 文蛤催产与组织取样  39

4.1.2 文库构建、质检与注释     40

4.1.3 差异表达基因（DEGs）分析    40

4.1.4 qPCR分析    40

4.2 结果 41

4.2.1 文蛤生殖次数统计分析     41

4.2.2 序列组装与注释  43

4.2.3 基因相关性分析  43

4.2.4 差异基因分析     45

4.2.5 KEGG富集分析    46

4.2.6 不同配子排放情况下DEGs表达分析      48

4.2.7 糖代谢相关基因表达差异  49

4.3 讨论 51

第5章 结论与展望     53

参考文献       55

附录       67

致谢       69

作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与其他相关学术成果    71

 

 

 

 

 

图目录

图1 1 文蛤性腺成熟状态（左）及排放过一次状态（右）   3

图2 1 文蛤催产   14

图2 2生殖后雌雄文蛤耗氧率变化    16

图2 3生殖后雌雄文蛤排氨率变化    16

图2 4 生殖后雌雄文蛤氧氮比变化   17

图2 5 生殖后雌雄文蛤摄食率变化   18

图2 6生殖后雌雄文蛤排粪率变化    18

图3 1生殖后雌雄文蛤糖原含量变化 26

图 3 2生殖后雌雄文蛤葡萄糖含量变化   26

图 3 3生殖后雌雄文蛤己糖激酶活性变化       27

图 3 4生殖后雌雄文蛤磷酸果糖激酶活性变化       27

图 3 5生殖后雌雄文蛤丙酮酸含量变化   28

图 3 6生殖后雌雄文蛤乳酸脱氢酶活性变化   29

图 3 7生殖后雌雄文蛤GP基因的相对表达差异    30

图 3 8生殖后雌雄文蛤GLUT基因的相对表达差异 30

图 3 9生殖后雌雄文蛤MFS基因的相对表达差异  31

图 3 10 生殖后雌雄文蛤的共表达韦恩图分析（A）与差异基因基因数目统计（B）  32

图 3 11 生殖后雌雄文蛤差异表达基因KEGG信号通路分类图    33

图 3 12生殖后雌雄文蛤的共表达韦恩图分析（A）与差异基因基因数目统计（B）  35

图 3 13生殖7 d后雌雄文蛤间KEGG信号通路富集散点图  35

图 4 1雌、雄文蛤生殖次数统计       42

图 4 2雌、雄文蛤不同生殖次数配子排放量统计   42

图 4 3 雌雄文蛤性腺转录组PCA分析雌（A）雄（B） 44

图 4 4雌雄文蛤不同排放配子次数性腺斯皮尔曼相关系数   44

图 4 5 雌雄文蛤性腺不同排放配子次数差异基因数目统计  45

图 4 6雌雄文蛤性腺不同排放配子次数差异基因韦恩图       46

图 4 7 差异基因聚类热图  46

图 4 8雌性文蛤性腺转录组差异表达基因KEGG信号通路富集分析图 47

图 4 9 雄性文蛤性腺转录组差异表达基因KEGG信号通路富集分析图       48

图 4 10雌雄文蛤在不同配子排放次数中糖代谢相关基因的qRT-PCR检测       50

表目录

表 1 1文蛤性腺发育周期与特点       4

表2 1文蛤生长数据    14

表 3 1本研究中qRT-PCR所用的引物     24

表 3 2样本测序数据质量汇总   31

表 3 3生殖0 d后与雄蛤相比雌蛤与糖代谢相关的差异基因相对表达水平       33

表 3 4样本测序数据质量汇总   34

表 4 1本研究中qRT-PCR所用的引物     40

表 4 2雌、雄文蛤生殖后体重变化   42

表 4 3样本测序数据质量汇总   43

表 4 4雌雄文蛤性腺转录组中的代谢相关差异表达基因列表       49